Summary
このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。
Abstract
患者由来のオルガノイドとその臨床的背景情報から卵巣がんバイオバンクを確立することは、研究と患者ケアの進歩を約束しますが、この致死的な悪性腫瘍の不均一性とオルガノイド技術の固有の複雑さが組み合わさったため、標準化は依然として課題です。この適応可能なプロトコルは、前駆細胞の患者固有の変動性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための体系的なフレームワークを提供します。最適な培養条件と播種方法を選択するための構造化された実験ワークフローを実装し、直接3D播種と2D/3Dルートの並列試験を行うことで、ほとんどの場合、幅広いダウンストリームアプリケーションに適した堅牢な長期増殖ラインが得られます。
特に、このプロトコルは、高悪性度および低悪性度の卵巣癌や、一次減量、再発性疾患、および術前補助術後の手術標本を伴う疾患の病期など、非常に不均一な出発物質の多数の症例(N = 120)でテストされ、有効であることが証明されています。低Wnt、高BMPの外因性シグナル伝達環境内では、前駆細胞がヘレグリン1β(HERβ-1)経路の活性化に対して異なる感受性を示し、HERβ-1がオルガノイド形成を促進するものと阻害するものがあることが観察されました。患者のサンプルのサブセットでは、最適なオルガノイド形成と長期増殖のために、線維芽細胞増殖因子10およびR-Spondin 1を培地に添加する必要があります。
さらに、組織消化と前駆細胞の単離の重要なステップを強調し、プラスチック上での2Dでの短時間の培養が、基底膜抽出物2型マトリックスにおけるその後のオルガノイド形成に有益である例を指摘します。全体として、最適なバイオバンキングには、個々のラインの適切な成長環境を特定するために、すべての主要な条件を並行して体系的にテストする必要があります。また、このプロトコルでは、包括的な表現型解析に必要なオルガノイドの高解像度画像を取得するための効率的な包埋、切片化、染色の処理手順についても説明しています。
Introduction
上皮性卵巣がん患者の臨床管理は、進行期における臨床症状の不均一性および再発率の高さにより、依然として困難である1。卵巣がんの発生と生物学的挙動の理解を深めるには、疾患の経過中の患者固有の変動性、治療反応、病理組織学的および分子的特徴に対処する研究アプローチが必要です2。
バイオバンキングは、卵巣がん患者に由来する腫瘍サンプルとその臨床情報を体系的に収集し、長期保存することを特徴としており、一次減量手術、ネオアジュバント化学療法後、再発性疾患からの腫瘍サンプルなど、さまざまな疾患ステージの大規模な患者コホートの保存を提供します。がん研究を前進させる貴重な可能性を秘めており、有望な予後バイオマーカーや治療標的のリソースとして機能します3。しかし、ホルマリンの固定や凍結などの従来のバイオバンキング法は、生存率の喪失と天然の3次元組織構造の破壊のために、元の腫瘍サンプルの機能研究を行うのに適していません4,5。
腫瘍学およびそれ以外の分野における分子メカニズムの研究は、疾患の生物学を忠実に反映し、in vivoで観察された組織のin vitro特性を維持する適切な実験モデルの使用に決定的に依存しています。患者由来のオルガノイドは、再生能の保存に基づいて、上皮の元の構造と機能を実験室で再現し、患者固有の状況での検査を可能にします。したがって、それらは癌研究と個別化医療のための非常に有望なツールとして浮上しており、臨床的多様性と実験室研究の間のギャップを埋めています6,7,8,9。オルガノイド株の個々の薬物反応と分子プロファイルの機能的関連性の試験に基づいて調整された治療戦略は、患者ケアに直接適用できる可能性があります10,11。患者固有の特性を含む長期的な培養の可能性と、関連する前向き臨床データの収集は、疾患の進行と耐性メカニズムに関与する新しい予後および予測因子を特定する上で大きな期待を寄せています3,9。
それにもかかわらず、異なる腫瘍サンプルからのオルガノイドを含むバイオバンクを構築するには、複雑な方法論の厳守と、メンテナンスを容易にするためのプロトコルの設定を組み合わせる必要があります12。プロセスの標準化により、高い離職率でも訓練を受けたスタッフがバイオバンクを効率的に確立および維持できると同時に、最高の品質基準を順守することができます13。いくつかの研究で、元の腫瘍の突然変異および表現型プロファイルに対応する安定した卵巣がんオルガノイド株の作製に成功したことが報告されているが、効率はさまざまである。しかし、日常的なバイオバンキングは、特に大規模な拡大やゲノム編集の成功の前提条件であるラインの長期安定的な成長のためには、実際には依然として課題となっています。
特に、拡張性の問題は、成長が遅く、限られた成長の可能性を示すオルガノイドが確立された系統としてカウントされることがあるため、この分野では曖昧なままです。Hoffmannらによって最初に実証されたように、その主要な発見がこのさらに開発されたプロトコルの基礎を提供した研究、卵巣癌組織の最適な取り扱いには、不均一性に対応するための独自の戦略が必要です14。この方法によって得られたオルガノイドの表現型特性評価および親腫瘍組織との密接な類似性は、成熟培養物(4〜10か月の培養)のパネルDNAシーケンシングおよびトランスクリプトミクス分析によって確認され、モデルの安定性が実証されました8,9,12,14。
健康な卵管の恒常性を調節するパラクリン環境とは対照的に、高悪性度漿液性卵巣がん(HGSOC)、がん再生能、およびオルガノイド形成能力をもたらす可能性が高い上皮層は、外因性Wnt補給への依存度が低い。さらに、オルガノイド培地にノギンが存在しないことを特徴とする活性骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、卵巣癌の固形組織沈着物からの長期培養の確立に有益であることが証明されました14,15。卵巣がんの固形沈着物の体系的なバイオバンキング中に、私たちはこれらの発見を確認し、パイプラインを設定し、このプロトコルで詳細を概説することで、大部分の症例で持続的な長期拡大を保証します。一次単離株を扱う場合、異なる培地組成と播種モダリティの並行試験は、長期安定オルガノイド株の確立を改善し、収率を高め、下流の実験に必要なマルチウェルフォーマットへの堅牢な増殖と増殖を可能にするために不可欠であることがわかりました16。
さらに、手術中に採取されたサンプルの純度と品質は、基礎研究や分子診断における卵巣がんオルガノイドのトランスレーショナルポテンシャルにとって非常に重要です。HGSOCの臨床症状は複雑であるため、外科医、腫瘍医、およびラボの科学者が緊密に協力して、関連する材料を正しく識別し、輸送条件を一定に保ち、各患者の疾患の最も重要な特徴を表すオルガノイド株を高効率で生成する必要があります。このプロトコルは、卵巣がんを特徴づける不均一性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための標準化された適応可能なフレームワークを提供します16,17。特に、このプロトコルは、さまざまな組織型(高悪性度および低悪性度卵巣がん、LGSOC)、幹細胞性調節に違いを示す同じ患者からの異なる沈着物、ネオアジュバント後の手術からの組織、生検材料、および疾患進行の再発期の手術からのサンプルを含む、幅広い卵巣がんの臨床症状の信頼性の高いバイオバンキングを可能にします。
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Protocol
卵巣がん手術からの腫瘍組織標本が収集され、患者由来のオルガノイドは、LMU大学の倫理委員会(17-471)に準拠して作成され、既存の適用されるEU、国内、および地域の規制に準拠しています。研究に関与する各患者は、書面による同意をしています。新鮮な組織サンプルを扱う場合は、バイオセーフティレベル2の安全許可と層流キャビネットが必要です。関連する感染症の定期的な検査がないため、組織サンプルの潜在的に感染性の性質を考慮すると、機関のバイオセーフティ規制が厳守され、実験を実施する担当者が適切な個人用保護具を利用できることを確認する必要があります。
1. 事前準備
- 培地調製
- 2Dおよび3D培地は週に1回新たに調製し、4°Cで保存します。
注:各培地の成分の正確な組成を 表1に示します。卵巣がん培地1(OCM1)とOCM2の両方にHER1β(最終濃度:50 ng/mL)を追加で補うことができ、OCM1、OCM1+HER1β、OCM2、OCM2+HER1βの4つの異なる状態になります。 - 成長因子試薬のストック溶液を作成し、20°Cで保存し、A83-01とニコチンアミド(+4°Cで保存)します。成長因子は温度に敏感であるため、培地調製には解凍した原液を直ちに使用し、アリコートを作成して融解サイクルの繰り返しを避けてください。
メモ: 培地の準備は、厳密に管理する必要がある重要なステップです。 - RSPO-1馴化培地の調製
- HA-R-Spondin1-Fc 293 T細胞(-80°Cで保存)を37°Cで迅速に解凍します。 10 mLの基礎培養培地に10%ウシ胎児血清(FCS)(以下、基礎培養培地++と呼ぶ)を添加して洗浄します。
- 細胞ペレットを12 mLの基礎培地++に再懸濁し、T75フラスコに播種します。
- 細胞が合流に達したら、トリプシンを含む解離試薬で細胞を1:6の比率で分割します(37°Cで4分間)。それらを新しいT75フラスコに播種します。
- 翌日、フレオマイシンD1(1.25μL/mL)を培地に加えます。
- 細胞がコンフルエントに達したら、トリプシンで1:20の比率で細胞を分割します(37°Cで4分間)。フレオマイシンD1を添加した30 mLの基礎培養培地++(10%FCSを含む)に細胞を複数のT75フラスコ(目的の最終容量に応じたフラスコの数)に播種します。
- 細胞がコンフルエンスの約50%に達したら、コンディショニング培地の生産を開始します:培地を、フレオマイシンD1を含まない5%FCSを添加した40 mLの基礎培地と交換します。
- 3日後に最初の上清を採取します。破片を除去するには、1,200 × gで10分間遠心分離します。上清を4°Cの滅菌容器に保管してください。
- 5%FCSを添加した新しい基礎培養培地を細胞に添加します。3〜4日後に2番目の上清を回収します。1,200 × gで10分間遠心分離します。最初の上澄みに2番目の上清を追加します。
- 0.2 μmのボトルトップフィルターを使用して、馴化培地を濾します。
- 品質管理およびRSPO1定量のために、作製した培地を293T細胞株(293T WntR、7xTcf-eGFP)14に添加し、GFPプラスミド担持Wntレポーター18で安定的に形質導入します。
注:GFPシグナルの量と強度に応じて、Wnt経路のアゴニストとしてのRSPO1の活性は、Wntレポーター細胞株の定量によってテストされます。 - 15 mLのアリコートは、4°Cですぐに(1週間以内に)使用するために保管してください。 長期保存(6ヶ月)の場合は、調整した培地を-20°Cに保管してください。
- 2Dおよび3D培地は週に1回新たに調製し、4°Cで保存します。
2. 卵巣癌オルガノイド培養の開始
- 初代組織の単離
- 新鮮で生存可能な組織を手術直後に輸送し、採取後最大20時間以内に単離します。約4°Cのコールドパックを備えた輸送ボックスを使用して、組織採取培地中の適切な輸送条件を確保します。
- ラボでは、タイムリーなサンプル処理を促進するために必要な試薬と機器を準備します。
- 基底膜抽出物II型マトリックス(BME 2マトリックス)を氷上で融解します(約2時間)。
- 使い捨てメス、滅菌した解剖ツール(ハサミとピンセット)、および50 mLチューブ用の400 μmサイズのフィルターインサートを準備します。
- 急速凍結用の液体窒素を少量入れた容器を用意し、37°Cに予熱したウォーターバスを用意します。
注:細胞培養層流フード内で作業します。
- ペトリ皿で新鮮な組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Ca++ およびMg++なし)で完全に洗浄します。シャーレの中で、使い捨てメスやハサミを使用して組織を3〜5mmの小さな小片に断片化します。
- 得られた組織を以下の目的で3つのセクションに分離します。
- 極低温チューブに組織を採取します。極低温チューブを液体窒素で満たされた準備された容器に移し、衝撃凍結します。
- 組織(2〜3 mm)をホルマリンで満たされた組織学的標本容器に集めて固定し(24時間)、染色目的でパラフィンに埋め込みます19,20。
- さらに、酵素消化の前に組織を均質化します。メスで機械的解離を最大化し、50 mLの組織チューブに移します。
注:組織が乾燥しないように、均質化中は常に組織がPBSに浸されていることを確認してください。
- ホモジナイズした組織を、PBS(Ca++ およびMg++を含まない)、コラゲナーゼI(原液5 U/μL、最終濃度1 U/μL)、および選択的ROCK1および2阻害剤(最終濃度3 μM)( 表1に記載の成分)を含む消化混合物と組み合わせます。腫瘍の2cm3 ごとに50mLチューブに15mLの消化混合物を使用します。
注:限られた材料(生検サンプルなど)では、酵素解離を確実にするために少量(約2〜3 mL)の消化混合物のみが必要です。 - 酵素解離の場合は、チューブを37°Cのウォーターバス中で1.5時間インキュベートします。 散発的かつ激しいボルテックス(約20分ごとに10〜15秒間)を行い、メカニックの解離をサポートします。
- インキュベーション後、15 mLの冷たい基礎培地++をチューブに加えます。300 × gで5分間遠心分離します。
- 上清を除去した後、新しい基礎培地++を5 mL添加します。400 μmフィルターを使用して細胞懸濁液を新しい50 mLチューブに濾します。
- 300 × gで5分間遠心分離します。上澄み液を取り除き、細胞ペレットを保管します。
- 赤血球を除去するには、5 mLの赤血球溶解(RBC)バッファーを細胞ペレットに加えます。ウォーターバス中で37°Cで5分間インキュベートします。
- 溶解不活性化のために5 mLの基礎培地++を添加します。300 × gで5分間遠心分離します。細胞ペレットに3 mLの基礎培地++を加えます。
- トリパンブルー染色液(例:サンプル10 μL + トリパンブルー染色液10 μL)で1:1に希釈した後、自動セルカウンターまたはノイバウアーチャンバーで手動で生細胞をカウントします。
- 直接 3D シード処理に必要なセルの数を計算します。各腫瘍沈着物について、播種マトリックス(OCM1、OCM1 + HER1ß、OCM2、OCM2 + HER1ß)の合計8〜12ウェルに対応する、卵巣癌培地あたり少なくとも2〜3ウェルを48ウェルフォーマットプレートに播種します。25 μL の BME タイプ 2 マトリックスの液滴中の各ウェルについて 30,000 個の細胞を計算します。オプションで、50 μL の BME 2 マトリックスとウェルあたり 50,000 個の播種細胞を含む 24 ウェルフォーマットを選択します。
- 残りのセルを2Dでシードします(ステップ2.1.13を参照)。
- 必要な細胞の総数を含む基底培養培地++懸濁液の量を新しいチューブにピペットで移し、300 × gで5分間遠心分離します。上澄み液を取り除き、細胞ペレットを保管します。
- 氷上で、コールドBME 2マトリックスの総量(48ウェルフォーマットプレートの各ウェルで25 μL、したがって、4ウェルで100 μL)をペレットに加え、気泡を作らずにペレットを静かに上下にピペッティングすることにより、ウェルあたりの細胞の均一な分布が得られるようにウェルを混合します。
- BME 2マトリックス(25 μL)の液滴に細胞を播種し、予熱した空の48ウェルプレートに播種します。ウェル間で均等に分配するには、チューブ内でピペットを上下に(3〜4回)ゆっくりと動かしてから、BME 2マトリックス液滴を各ウェルに移し、分配中の細胞沈殿を防ぎます。
- プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートしてBME2マトリックスの液滴を固めた後、4つの卵巣がん培地(OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß)のそれぞれ250μLを対応するウェルにピペットで移します。
- 直接3D播種手順と並行して、2D培養を開始して、残りの単離細胞を保存します。
- 300 × gで5分間遠心分離した後、ペレットを2D培地に添加します。3D播種後に使用可能な細胞の数に応じて、フォーマット(T75フラスコまたはT25フラスコ)を選択します。
- フラスコを37°Cで3〜5日間インキュベートし、細胞接着を行います。最初の72時間は同じ培地を保ちます。
- 細胞が合流に達したら、培養液を BME 2 マトリックスに移します。2D培養で一次分離株を分割して増殖させないでください(2Dでの長期増殖は幹細胞性の可能性に有害であるため)。
- 2D培養から3D培養への移行
- T75 または T25 フラスコで、単層を 5 mL の PBS で 2 回洗浄し、細胞を底面から剥離します。1 mLのトリプシンとともに、37°Cで10分間インキュベートします。
- 解離試薬の不活性化のために、5 mLの冷たい基礎培地++を加えます。300 × gで5分間遠心分離します。
- 3 mLの基礎培地++をペレットに加えます。手順2.1.12-2.1.13の説明に従ってセルをカウントします。ステップ2.1.16-2.1.18で説明したように、さまざまな培地組成物( 図1を参照)のシード。
- オルガノイド増殖の評価
- 少なくとも週に一度はウェルを画像化して、オルガノイドの成長を記録します。位相差顕微鏡により、2D/3D培養と直接播種プレートの高品質な比較画像を作成します。倍率の一貫性に注意し、ウェルの概要(定量)には 4 倍、オルガノイドの形態の記録には 10 倍と 20 倍を使用します。
- 個々の行専用のフォルダに画像のストレージを整理します。
- 異なる播種モダリティ(2D播種モダリティ、3D播種、直接3D播種)および異なる培地組成(OCM1、OCM1+ HER1ß、OCM2、OCM2+ HER1ß)でのオルガノイド形成の比較評価により、長期培養に最適なオルガノイド株を選択します。
- 平均して、単離後14〜21日で、オルガノイド形成能(量)と、さまざまな条件下で増殖したオルガノイドのサイズと細胞表現型を評価します。液胞がない、膜がブレブまたは接着を失っている、細胞が丸められるなどの特徴を探します。
3. オルガノイドの長期培養
- オルガノイド継代
- オルガノイドの分裂を頻繁に行いすぎたり、増殖期に分裂させたりすることは避けてください。機械的および酵素的消化手順を10日以上の間隔で実施します。
- 各 BME 2 マトリックス液滴を破壊するには、250 μL(48 ウェルフォーマット)または 500 μL (24 ウェルフォーマット)の氷冷基礎培地++を添加します。液滴とピペットが断続的に上下に完全に溶解し、プレートの底をこすります。細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、氷上に置いてください。氷冷した基礎培地++を1mL加えます。
注:BME 2マトリックスの除去効率は、4°C以下で最良の溶解が得られるため、媒体温度に大きく依存します。 - プール2-3は、均一な拡張のために井戸を技術的に複製します。300 × gで5分間遠心分離します。懸濁液の内容物を光源に照らして検査し、BME 2ゲルがまだ見えるかどうかを確認します。上清を取り除き、BME 2マトリックスがまだ見える場合は、氷冷した培地で洗浄を繰り返します。
- 1 mLのトリプシン(20〜25°Cで保存)を37°Cのウォーターバスで7〜10分間インキュベートします。10秒間散発的に渦巻き、解離を促進します。定期的にチューブを目視で検査し、解離が進行していないか確認してください。
- 23 Gから27 Gの範囲のサイズの針を通してシリンジで細胞懸濁液を上下に引っ張ります。
注:シリンジによるフラグメンテーションはオプションであり、針のサイズは必要な解離効果によって異なります。均質な細胞懸濁液は、ウェル間に均等に分布します。 - 1 mLの冷たい基礎培地++を添加して反応を不活性化します。
- オプション:ステップ2.1.12-2.1.13の説明に従って細胞をカウントし、親継代に対する分割比を決定します(例:1:3ウェル)。
- 300 × gで5分間遠心分離します。上澄みを取り除きます。
- ステップ2.1.16-2.1.18に記載されているように播種を行い、すでに確立されている長期培養に従って、それぞれに最適な卵巣癌オルガノイド培地を適用します。卵巣がん培地は3〜4日ごとに交換してください。
- 培地交換中にBME2マトリックス液滴が破砕された場合は、酵素消化を行わずに再播種することを検討してください。液滴の破壊を避けるため、BME 2マトリックス液滴に直接ピペッティングすることなく、培地交換手順を慎重に行ってください。さらに、ステップ2.1.16でBME2マトリックスで希釈する前に、ペレットに過剰な量の残留基礎培地++を残すことは、液滴の脆弱性に影響を与える可能性があるため、避けてください。
- オルガノイドの凍結保存
注:オルガノイドの凍結保存は、継代後1週間の増殖期に行ってください。- ステップ3.1.2に従って、氷冷した基礎培地++でBME 2マトリックス液滴を破壊します。ステップ3.1.3.で説明したように上清を遠心分離して廃棄した後、氷上で作業し、細胞ペレットを氷冷凍結保存培地1 mLに再懸濁します。細胞懸濁液を標識済みの1.8 ml極低温チューブに移します。
- チューブは予冷したイソプロピルアルコール含有凍結容器に保管し、-80°Cで一晩置きます。
- ストックチューブを-80°Cで最大2ヶ月間保管してください。液体窒素に移し替え、長期安定保存が可能です。
- オルガノイドストックの融解
- 標識付き15 mLチューブ内の37°Cの水浴中で、9 mLの基礎培地++を予温します。
- 所望のストックバイアルを-80°Cの保管庫から液体窒素に移すか、液体窒素で満たされた輸送容器に移します。
- クライオチューブを37°Cのウォーターバスに移し、チューブの壁近くの凍結物質が解凍し始めるまで静かに攪拌します。
- オルガノイド懸濁液を、9 mLの培地で満たされた標識チューブにゆっくりと分配します。チューブを静かに振ってください。300 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- ステップ2.1.16-2.1.18に記載されているように播種を行い、個々の系統についてすでに決定されている長期培養条件に従って、それぞれに最適な卵巣癌オルガノイド培地を適用します。
- オルガノイドの固定
- 手順3.1.2-3.1.3の説明に従ってオルガノイド収集を実行します。
- PBS(pH 7.4)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)3 mLを加え、室温で1時間インキュベートします。
- 5 mLのPBSで2回洗浄し、300 × gで3分間遠心分離し、上清を除去します。4 mLの新鮮なPBSをペレットに加え、包埋するまで4°Cに保ちます。
注:固定オルガノイドは安定しており、包埋前に4°Cで1ヶ月間保存できます。 - 組織学的ゲル(-20°Cで保存)を65°Cで液化するまで加熱します。
- チューブの底部に沈殿して見える固定オルガノイドを検出します。上澄みを取り除きます。細胞ペレットが破砕された場合は、300 × g で3分間遠心分離を行い、上清PBSを廃棄します。
- ペレットを100μLの温かいゲルに静かにピペッティングして懸濁します。液滴をシーリングフィルムに移し、室温で~15分後に凝固させます。
- 固定したゲル液滴を組織パラフィンカセットに移動します。標準的な組織包埋プロトコルを実施する19,20.
- 5〜10μmの厚さのスライスをマイクロセクショニング切削工具で切断します。切り口を組織学スライドに移します。スライドを65°Cで1時間乾燥させます。乾燥した場所に保管してください。
- オルガノイド切片の免疫蛍光染色
- 準備したスライドを、次の希釈シリーズでガラストレイに通します:組織学用の2 x 15分間の透明化剤。15分100%エタノール;1分間100%エタノール;10分間96%エタノール;5分間70%エタノール;5分間50%エタノール。
- PBSを添加し、シェーカー上で100rpmで5分間保持します。洗濯を2回繰り返します。
- 抗原賦活化溶液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)-緩衝液[pH 9.0]またはクエン酸[pH 6.0])を、耐熱性チャンバーに入れたスライドに添加します。蒸し器で、スライドの入った容器を30分間保管した後、室温まで冷まします。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- スライドの入ったチャンバーを1%透過性界面活性剤溶液(PBS中)に15分間移します。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- スライド上のオルガノイドの位置を免疫染色ワックスペンで輪郭を描き、以下のステップで液滴を維持します。
- 二次抗体の種類に応じて、希釈培地に100 μLの10%血清を各スライドに加えます。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- 一次抗体を培地で希釈し、最終容量が100 μLになるようにします。 インキュベーショントレイ/湿度チャンバー内で4°Cで少なくとも16時間保持します。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- 二次抗体を培地で希釈し、液滴を100 μLとし、インキュベーショントレイで室温で2時間保存します。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- 希釈培地で1:1,000に希釈した核対比染色液DAPI(4',6-ジアミジン-2-フェニルリンドール、二塩酸塩)を加えます。インキュベーションのために室温で10分間保管します。
- 手順 3.5.2 を繰り返します。
- 封入剤を追加し、カバーガラスで覆います。乾いたら(約8〜12時間後)、透明なマニキュアでスライドを固定します。
- 共焦点顕微鏡などの蛍光顕微鏡で撮影します。オルガノイド形態の主な特徴を捉えた細胞内構造の概要写真と詳細な画像を作成します。
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Representative Results
最初の組織解離、濾過、およびカウントの後、細胞は、上記で説明したように、3Dフォーマットで直接並行して播種され、フラスコ内の懸濁液で短時間の2D増殖が行われます。場合によっては、一過性の2D増殖がオルガノイド形成にプラスの影響を与え、この経路を介して長期的なラインが正常に確立されますが、比較並行3Dシーディングは成長停止をもたらす可能性があります(図1)。処理された各ドナー組織について、細胞は培地マトリックスに従って検査されます。この戦略に従って、当社のバイオバンクには、 図2に示すように、各標準生育条件を代表するラインが含まれています。さまざまな培地と播種モードをテストするこのミニスクリーニングプラットフォームを厳密に実施することにより、卵巣がんのさまざまな組織学的タイプと疾患発症段階(図3)から、一次高悪性度漿液性、ネオアジュバントインターバル手術後、および再発性疾患からオルガノイド株を生成することに成功しました。親組織と比較した主要マーカーの免疫蛍光染色によるオルガノイド株の表現型特性評価は、上皮腫瘍区画の特徴がオルガノイドモデルに保持されていることを説得力を持って示しています:上皮構造と接着(EpCAM)、系統同一性(PAX8)、および核への蓄積につながるHGSOCに特徴的な典型的なTP53点変異(図4)。
オルガノイドバイオバンキングにおける効率的な意思決定のためには、いくつかの重要な方法論的ポイントも考慮する必要があります。オルガノイドの成長ポテンシャルは、オルガノイド直径の増加によってのみ決定されるわけではありません。さらに、表現型特性は、色、暗さ、輪郭の完全性などの膨張電位を決定します。細胞質ストレス液胞の形成は、最適ではない状態を示します。増殖およびオルガノイド形成能に関する最初の問題は、不適切な輸送条件および組織行列の遅延により発生する可能性がある。腫瘍株内では拡大電位の個人差が大きいため、増殖能について最終決定を下す前に少なくとも14日間待つことをお勧めします。異なる培地で類似した増殖パターンが最初に観察される場合は、複数の条件を展開する必要があります。私たちの経験から、長期安定的な成長の可能性を明確に区別することは、数週間または数か月の栽培後にのみ可能になることがよくあります。
図1:その後のオルガノイド生成のための一次分離株の2Dでの短時間の播種の利点。 (A)4つの異なる培地での2D/3Dおよび直接3Dシーディングの2ウェイパラレルシーディング戦略を示す実験レイアウトのスキーム。(B)トリプシン処理および3D転写前の接着一次分離株の画像。(C)パラレルシーディングが実施された一次堆積物の例では、最初にプラスチック上で単離された前駆細胞からのみ長期的なオルガノイド増殖が可能であるため、2D/3Dルートの明らかな利点が明らかになりました。左上の画像は、左下の写真の継代0(P1)後のオルガノイド形成が不十分で、継代0(P0と呼ぶ)で単離してから7日後の3D培養を示しています。プラスチックへの2D播種( 図1Bを参照)に続いて3D培養物に移した後、P0でより良好なオルガノイド形成がすでに明らかであり、継代4(P4)で長期的な増殖能が確認されています。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:患者固有の培地要件。 4つの異なる長期安定拡張線の例は、それぞれ異なる培地で成長する。スケールバー = 500 μm。略語:OCM =卵巣がん培地;her = ヘレグリン 1β;HGSO = 高悪性度漿液性卵巣がん。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:疾患のすべての段階からのオルガノイド生成。 原発性疾患の高悪性度漿液性および低悪性度漿液性卵巣癌、中間手術(術前補助化学療法後)、および再発癌組織からの長期安定な拡大線の画像。スケールバー = 500 μm。略語:HGSOC = 高悪性度漿液性卵巣がん;LGSOC = 低悪性度漿液性卵巣がん;NACT = ネオアジュバント化学療法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:オルガノイドの表現型と親がん組織の密接な一致。 (A)がん組織と(B)対のオルガノイド株の免疫蛍光染色の共焦点画像は、すべてのマーカー、EpCAM(緑)、PAX8(赤)、TP53(マゼンタ)の染色パターンと発現レベルにおいて非常に高い類似性を示しています。スケールバー = 20 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:このプロトコルで使用される培地と消化混合物の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
設計されたプロトコルは、オルガノイド形成と長期継代の可能性に関する卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの以前の課題に対処し、固形腫瘍沈着物の大部分から完全に拡張可能なラインの生成を保証します。オルガノイドの生成に使用される腫瘍サンプルの外科的収集プロセスは、収量と増殖の可能性に大きく影響します。腫瘍組織サンプルは、多臓手術、診断的腹腔鏡検査、生検など、さまざまな手順で採取できます。経験豊富な婦人科腫瘍外科医は、腹膜位置からきれいな腫瘍サンプルを取得することを優先する必要があります。特に、大きな腫瘍沈着物内の肉眼的に壊死した領域は、オルガノイド培養の成功にはあまり適していないことが観察されています。サンプルの純度は、ダウンストリームアプリケーション用の分子および表現型特性を反映するために重要であるため、最適なバイオバンキングのためには、臨床チームと検査チームの両方が同期して取り組み、腫瘍の最も関連性の高い領域からラインが作成されるようにする必要があります。
このプロトコルは、バイオバンキングの2年間に観察された成長因子依存性の変動をカバーしていますが、症例の20%でオルガノイドの成長が観察されず、限られた拡張の可能性を示した系統の数が幹細胞性の最適ではない維持を示唆していたため、有効性をさらに高めるためにさらなる改良が必要であることは明らかです。現在、オルガノイドバイオバンクには漿液性組織学(HGSOCおよびLGSOC)の卵巣がんサンプルのみが含まれていますが、構造化バイオバンキングプログラム以前のさまざまな上皮性卵巣がん組織型からのサンプルを使用した経験では、特定の違いなしに同等の成功率が示されました。特に、上皮性卵巣がんのサブタイプの大部分は、ミュラー管(卵管、子宮、子宮頸部)から発生した組織と同様の円柱状の偽層状形態を共有していますが、対照的に、卵巣上皮自体は生殖尖尾と中腎から発生し、直方体上皮の単層で覆われています。上皮の恒常性を調節する発生経路は、成体幹細胞の電位の制御において中心的な役割を果たすため、オルガノイドのバイオバンキングのプロトコルを開発する際には、胚起源の違いを考慮する必要があります。したがって、卵巣表面からの前駆細胞は、長期にわたって安定した成長を維持するために、臓器特異的な培養条件を必要とする可能性が高いと考えています。
特に、私たちの研究室では、ネオアジュバント化学療法は細胞の生存率と組織の表現型に影響を与えますが、ネオアジュバント後の卵巣がんサンプルに対してもプロトコルが成功することが証明されています。これらのサンプルは、オルガノイド形成の可能性に影響を与える可能性のある一次減量手術の化学療法未経験組織に由来するサンプルと比較して、より多くの破片および細胞外組織凝集体を示します。これらのケースでは、ネオアジュバント後のサンプルはより感度が高い可能性があるため、オルガノイドの作製を成功させるには、適切な量の手術組織と推奨される輸送条件の厳守が重要であることが分かりました。
新たに単離された前駆細胞の2Dにおけるプラスチック上の短時間の膨張がその後のオルガノイド増殖に及ぼす有益な効果の非常に興味深い現象は、繰り返し観察され、したがって標準化された実験手順に含まれていますが、 癌オルガノイド研究分野の方法論、主に直接播種戦略に依存しています。酵素消化後の前駆細胞の感受性と、それらを適切に呼び起こす成長因子の能力が、この違いの背後にある根本的なメカニズムである可能性があると推測したくなります。ただし、明確な依存関係を確立するには、さらなる研究が必要です。
消化が困難な3D卵巣がんオルガノイドの高い細胞接着性と機能的接合部がもたらす課題に対処するために、針とシリンジによる機械的および酵素的解離の組み合わせは、トリプシン処理後に大きな塊が残る場合に役立つ可能性があります。さまざまな酵素条件で実験することで、さらなる改善につながる可能性があります。
長期保存後、オルガノイド株を融解し、実験デザインに従って培養し、その後の用途に使用することができます。これにより、特定の研究目的ですでに生成されたオルガノイド株にいつでもアクセスでき、患者の疾患進行に照らして特定のオルガノイド株の長期的な挙動を調査するために特に興味深いものです。しかし、卵巣がんオルガノイドの凍結保存は依然として課題です。凍結および融解サイクル中の温度変化は、オルガノイドの生存率、機能性、および増殖能に悪影響を与える可能性があります。液体窒素では長期保存がより安定しており、非常に低い温度で分解のリスクが最小限に抑えられ、オルガノイドの完全性を維持できます。ただし、凍結、保管、融解の一貫した手順を確立し、これらのプロセスをさらに改善するには、継続的な最適化が必要です。
前述の未解決の問題にもかかわらず、このプロトコルは、卵巣がん患者の固形腫瘍サンプルから安定したオルガノイド株を一貫して生成する能力を示しています。当研究室では、これまでに120件の原発性卵巣がん組織検体を解析し、原発性減量術、再発性、術前補助術後の手術標本など、幅広い組織学的サブタイプや病期を含む約50%の症例で成功を収めています。このプロトコルは、さまざまな患者サンプルに由来するオルガノイドの生成、異なる培地での並行播種、および異なる播種戦略の実施のための構造化されたフレームワークを提供することにより、幹細胞電位の個人差を評価する機会を提供し、腫瘍生物学に関する追加情報を提供します。私たちの知る限り、大多数の研究は通常、少数のサンプルで培地成分をテストし、簡単にするためにほとんどが最適な培地を1つ選択するという逆のアプローチに従います。HER1βの効果、RSPO1とFGF10の補給の効果、および2D/3D播種の系統的試験は、卵巣がん組織が幹細胞性特性にある程度の患者間変動性を持ち、最適な培地が実際に患者特異的であることを決定的に示しています。したがって、異なる外因性パラクリンシグナル伝達環境を提供する異なる培地組成の体系的な並行試験が不可欠です。
さまざまな卵巣がん患者に由来するオルガノイドの広範なパネルと、前向きに収集された臨床情報を備えた生きたバイオバンクを確立することは、幅広い研究用途にとって貴重なリソースとして機能し、より多くの患者集団に適用できる可能性のある不均一な臨床状況を反映しています17。.長期培養と凍結保存により、実験の一貫性と、同じオルガノイド株を経時的に繰り返し入手することができ、腫瘍株の細胞特性が変わらない縦断的実験デザインの基礎となります。
オルガノイド株は、上皮構造と分極を保持することにより、パラクリンシグナル伝達経路によって媒介される細胞間コミュニケーションと状況依存的な細胞運命決定を研究するための適切なモデルです。組織学的ゲルへのオルガノイドの包埋は、固定後の材料の損失を回避するための実用的で効率的な中間ステップであり、下流の処理(パラフィンへの包埋と切片化)を組織サンプルと並行して実行できるようにします。固定手順中のオルガノイドの損失は、オルガノイドの数が非常に限られている場合に重大な問題です。しかし、この損失は、冷たい基礎培地で洗浄し、固定前に24ウェルフォーマットプレートの少なくとも2つの成熟ウェルをプールすることによって、細胞外マトリックスからオルガノイドを完全に除去することによって打ち消すことができます。免疫蛍光染色プロトコルは、卵巣癌オルガノイドの分子的および表現型的特徴を親の腫瘍組織と対応させる高解像度共焦点イメージングを可能にしますが、化合物に対する細胞応答や遺伝子組み換え株の特性評価を研究するための貴重なツールでもあります。この方法は、特定の修正を伴わない組織学染色にも適しています。研究の目的に応じて、ミクロトーム(2〜3μm)で切断されたより薄い切片を検討する必要があります。
重要なことに、安定した長期培養は、新規および標準治療に対する薬物反応および耐性に関する遺伝子編集実験および機能アッセイの前提条件である17,21。特に、疾患の進行および再発時に実施される再生検から生成されたオルガノイドは、治療歴のない元の腫瘍と、再燃中に観察された新たに獲得された特徴との間の直接比較分析の可能性を提供します。患者固有の治療反応の特定とin vitroでの治療抵抗性の形成は、卵巣がん研究における精密医療の分野を前進させます21。
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Disclosures
M.K.は、卵巣がんオルガノイドの培地に関する特許の発明者として登録されています。F.T.は、アストラゼネカ、クロービス、エーザイ、イムノジェン、メダック、MSD、ファーママー、ロシュ、SAGAダイアグノスティックス、テサロ/GSKから研究資金、アドバイザリーボード、謝礼、旅費を受け取りました。S.M.は、研究資金、アドバイザリーボード、名誉または旅費を受け取りました:アッヴィ、アストラゼネカ、クロービス、エーザイ、グラクソ・スミスクライン、Hubro、メダック、MSD、ノバルティス、ナイコーデ、オリンパス、ファーママー、ファイザー、ロシュ、センサーキネシス、テバ、テサロ。
Acknowledgments
この研究は、DKFZとミュンヘン大学病院LMUのパートナーシップであるドイツがん研究センターDKTK、パートナーサイトミュンヘンから資金提供を受けています。この研究は、ドイツのがん援助助成金(#70113426および#70113433)によっても支援されています。組織とオルガノイドのパラフィン包埋は、ミュンヘンのLMUミュンヘンにある医学部解剖学研究所のコア施設で実施されています。共焦点イメージングは、バイオメディカルセンター(BMC)のコア施設であるバイオイメージングで実施されています。著者は、技術的な支援をしてくれた Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink、Martina Rahmeh に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
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