Summary
Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.
Abstract
Embora o estabelecimento de um biobanco de câncer de ovário a partir de organoides derivados de pacientes, juntamente com suas informações de antecedentes clínicos, prometa avanços na pesquisa e no cuidado ao paciente, a padronização permanece um desafio devido à heterogeneidade dessa malignidade letal, combinada com a complexidade inerente da tecnologia organoide. Este protocolo adaptável fornece uma estrutura sistemática para realizar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando uma variabilidade paciente-específica de progenitores. Ao implementar um fluxo de trabalho experimental estruturado para selecionar condições ideais de cultura e métodos de semeadura, com testes paralelos de semeadura 3D direta versus uma rota 2D/3D, obtemos, na maioria dos casos, linhas de expansão robustas de longo prazo adequadas para uma ampla gama de aplicações downstream.
Notavelmente, o protocolo tem sido testado e se mostrado eficiente em um grande número de casos (N = 120) de material de partida altamente heterogêneo, incluindo câncer de ovário de alto e baixo grau e estádios da doença com debulking primário, doença recorrente e espécimes cirúrgicos pós-neoadjuvantes. Dentro de um ambiente de sinalização exógena de baixo Wnt e alto BMP, observamos progenitores sendo diferentemente suscetíveis à ativação da via da Heregulina 1 ß (HERß-1), com o HERß-1 promovendo a formação de organoides em alguns enquanto o inibe em outros. Para um subconjunto das amostras do paciente, a formação ideal de organoides e o crescimento a longo prazo requerem a adição do fator de crescimento de fibroblastos 10 e R-Spondin 1 ao meio.
Além disso, destacamos as etapas críticas da digestão do tecido e do isolamento do progenitor e apontamos exemplos em que o breve cultivo em 2D em plástico é benéfico para a subsequente formação de organoides na matriz do Extrato de Membrana Basal tipo 2. Em geral, o biobanco ideal requer testes sistemáticos de todas as principais condições em paralelo para identificar um ambiente de crescimento adequado para linhas individuais. O protocolo também descreve o procedimento de manuseio para incorporação, secção e coloração eficientes para obter imagens de alta resolução de organoides, o que é necessário para uma fenotipagem abrangente.
Introduction
O manejo clínico de pacientes com câncer epitelial de ovário permanece desafiador devido à sua apresentação clínica heterogênea em estágios avançados e altas taxas derecorrência1. Melhorar nossa compreensão do desenvolvimento do câncer de ovário e do comportamento biológico requer abordagens de pesquisa que abordem a variabilidade específica do paciente durante o curso da doença, a resposta ao tratamento e as características histopatológicas e moleculares2.
O biobanco, caracterizado pela coleta sistemática e preservação a longo prazo de amostras tumorais derivadas de pacientes com câncer de ovário, juntamente com suas informações clínicas, oferece a preservação de uma grande coorte de pacientes em diferentes estágios da doença, incluindo amostras tumorais de cirurgias primárias de citor, após quimioterapia neoadjuvante e de doença recorrente. Possui um potencial valioso para o avanço da pesquisa do câncer, servindo como um recurso de promissores biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos3. Entretanto, os métodos convencionais de biobanco, como fixação e congelamento de formalina, não são passíveis de estudos funcionais nas amostras tumorais originais devido à perda de viabilidade e à ruptura da arquitetura tecidual tridimensionalnativa4,5.
Estudos de mecanismos moleculares, em oncologia e fora dela, dependem crucialmente da utilização de modelos experimentais apropriados que reflitam fielmente a biologia da doença e mantenham as propriedades in vitro do tecido observado in vivo. Os organoides derivados do paciente, baseados na preservação do potencial de renovação, reproduzem em laboratório a estrutura e a função originais do epitélio e permitem o teste em um contexto específico do paciente. Portanto, eles têm emergido como ferramentas altamente promissoras para a pesquisa do câncer e medicina personalizada, fazendo a ponte entre a diversidade clínica e a pesquisa laboratorial6,7,8,9. Estratégias terapêuticas adaptadas, baseadas em respostas individuais a drogas de linhagens organoides e testes da relevância funcional de perfis moleculares, podem potencialmente ser aplicadas diretamente ao cuidado do paciente10,11. A possibilidade de cultivo em longo prazo, incluindo características específicas do paciente e a coleta de dados clínicos prospectivos relevantes ao longo do tempo, é uma grande promessa para identificar novos fatores prognósticos e preditivos envolvidos na progressão da doença e nos mecanismos de resistência 3,9.
No entanto, a construção de um biobanco que inclua organoides de diferentes amostras tumorais requer uma combinação de estrita adesão à metodologia complexa e estabelecimento de protocolos de fácilmanutenção12. A padronização do processo garante que o biobanco possa ser estabelecido e mantido de forma eficiente por pessoal treinado, mesmo em alta rotatividade, ao mesmo tempo em que adere aos mais altos padrões de qualidade13. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de linhagens organoides estáveis de câncer de ovário correspondentes ao perfil mutacional e fenotípico do tumor original com taxas de eficiência variáveis. Ainda assim, o biobanco de rotina continua desafiador na prática, particularmente para o crescimento estável de longo prazo das linhas, que é um pré-requisito para expansão em grande escala ou edição genômica bem-sucedida.
Em particular, a questão da expansibilidade permanece vagamente definida no campo, pois organoides que apresentam potencial de crescimento lento e limitado são ocasionalmente contados como linhas estabelecidas. Como demonstrado inicialmente por Hoffmann et al., um estudo cujos principais achados forneceram a base para esse protocolo mais desenvolvido, o manuseio ideal do tecido do câncer de ovário requer uma estratégia única para acomodar a heterogeneidade14. A caracterização fenotípica dos organoides obtidos por este método e a estreita similaridade com o tecido tumoral parental foram confirmadas por sequenciamento de DNA em painel e análise transcriptômica de culturas maduras (4-10 meses de cultivo), demonstrando a estabilidade do modelo8,9,12,14.
Em contraste com o ambiente parácrino que regula a homeostase nas tubas uterinas saudáveis, a camada epitelial, que provavelmente produz câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC), potencial de regeneração do câncer e capacidade de formação de organoides, é menos dependente da suplementação exógena de Wnt. Além disso, a sinalização ativa da Proteína Morfogenética Óssea (BMP), caracterizada pela ausência de Noggin em meio organoide, mostrou-se benéfica para o estabelecimento de culturas de longo prazo a partir de depósitos de tecido sólido de câncer deovário14,15. Durante o biobanco sistemático de depósitos sólidos de câncer de ovário, confirmamos esses achados e montamos o pipeline, com detalhes delineados neste protocolo que garante uma expansão sustentada a longo prazo na maioria dos casos. Descobrimos que testes paralelos de diferentes composições de meios e modalidades de semeadura quando se trabalha com isolados primários são essenciais para melhorar o estabelecimento de linhagens organoides estáveis a longo prazo e aumentar a produtividade, permitindo propagação e expansão robustas para formatos de poços múltiplos necessários para experimentos a jusante16.
Além disso, a pureza e a qualidade das amostras coletadas durante a cirurgia são de importância crucial para o potencial translacional dos organoides do câncer de ovário na pesquisa básica e no diagnóstico molecular. A complexidade da apresentação clínica do HGSOC requer uma estreita cooperação entre os cirurgiões, oncologistas e os cientistas do laboratório para garantir que o material relevante seja corretamente identificado, as condições de transporte sejam mantidas constantes e as linhas organoides sejam geradas com alta eficiência, representando as características mais importantes da doença de cada paciente. Este protocolo fornece uma estrutura padronizada, mas adaptável, para capturar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando a heterogeneidade que caracteriza o câncer deovário16,17. Notavelmente, este protocolo permite um biobanco confiável do amplo espectro de apresentação clínica do câncer de ovário, incluindo diferentes tipos histológicos (câncer de ovário de alto e baixo grau, LGSOC), diferentes depósitos das mesmas pacientes que exibem diferenças na regulação do tronco, tecidos de cirurgias em cenário pós-neoadjuvante, material de biópsia e amostras de cirurgias na fase recorrente de progressão da doença.
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Protocol
Espécimes de tecido tumoral de cirurgias de câncer de ovário foram coletados e organoides derivados da paciente foram gerados em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade LMU (17-471), aderindo aos regulamentos existentes aplicáveis da UE, nacionais e locais. Cada paciente envolvido no estudo consentiu por escrito. Ao trabalhar com amostras de tecido fresco, a permissão de segurança de Nível 2 de Biossegurança e os gabinetes de fluxo laminar são necessários. Dada a natureza potencialmente infecciosa das amostras de tecido, que não pode ser descartada devido à falta de testes de rotina de doenças infecciosas relevantes, é necessário garantir que as regulamentações institucionais de biossegurança sejam rigorosamente cumpridas e que equipamentos de proteção individual adequados estejam disponíveis para o pessoal que conduz os experimentos.
1. Preparações
- Preparação do meio
- Prepare os suportes 2D e 3D frescos uma vez por semana e guarde-os a 4 °C.
NOTA: A composição exata dos ingredientes para cada meio está listada na Tabela 1. Tanto o meio de câncer de ovário 1 (OCM1) quanto o OCM2 podem ser adicionalmente suplementados por HER1ß (concentração final: 50 ng/mL), resultando em quatro condições diferentes: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß. - Criar soluções-mãe dos reagentes do factor de crescimento e mantê-los a 20 °C e de A83-01 e nicotinamida (armazenamento a +4 °C). Devido à sensibilidade à temperatura dos fatores de crescimento, use soluções estoque descongeladas imediatamente para a preparação do meio e evite ciclos repetidos de descongelamento criando alíquotas.
NOTA: A preparação da mídia é uma etapa crítica que precisa ser rigorosamente controlada. - Preparo de meio condicionado RSPO-1
- Descongelar células HA-R-Spondin1-Fc 293 T (armazenamento a -80 °C) rapidamente a 37 °C. Lavá-los com 10 mL de meio de cultura basal, suplementado com soro fetal de bezerro a 10% (SFB), doravante denominado meio de cultura basal++.
- Ressuspender o pellet celular em 12 mL de meio de cultura basal++ e semeá-lo em frasco T75.
- Dividir as células numa proporção de 1:6 com um reagente de dissociação contendo tripsina (4 min a 37 °C) quando as células atingirem a confluência. Semeá-los num novo balão T75.
- No dia seguinte, adicionar fleomicina D1 (1,25 μL/mL) ao meio.
- Dividir as células numa proporção de 1:20 com tripsina (4 min a 37 °C) quando as células atingirem a confluência. Semeando as células em frascos múltiplos de T75 (número de frascos de acordo com o volume final pretendido) em 30 mL de meio de cultura basal++ (contendo 10 % de SFB) suplementado com fleomicina D1.
- Iniciar a produção do meio condicionado quando as células atingirem aproximadamente 50% de confluência: substituir o meio por 40 mL de meio de cultura basal suplementado com 5% de SFB sem fleomicina D1.
- Coletar o primeiro sobrenadante após 3 dias. Para remover os detritos, centrifugar por 10 min a 1.200 × g. Manter o sobrenadante num recipiente estéril a 4 °C.
- Adicionar novo meio de cultura basal suplementado com 5% de SFB às células. Coletar o segundo sobrenadante após 3-4 dias. Centrifugar por 10 min a 1.200 × g. Adicione o segundo sobrenadante ao primeiro sobrenadante.
- Coe o meio condicionado usando um filtro superior de garrafa de 0,2 μm.
- Para controle de qualidade e quantificação de RSPO1, adicionar o meio produzido a uma linhagem celular 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, transduzida de forma estável com plasmídeo GFP carregando Wnt repórter18.
NOTA: Dependendo da quantidade e intensidade do sinal de GFP, a atividade de RSPO1 como um agonista da via Wnt é testada pela quantificação da linhagem celular repórter Wnt. - Manter alíquotas de 15 mL para uso imediato (dentro de 1 semana) a 4 °C. Para armazenamento mais longo (6 meses) manter o meio condicionado a -20 °C.
- Prepare os suportes 2D e 3D frescos uma vez por semana e guarde-os a 4 °C.
2. Início de uma cultura organoide de câncer de ovário
- Isolamento tecidual primário
- Transportar tecido fresco e viável preferencialmente imediatamente após a cirurgia e realizar isolamento em até 20 h após a coleta. Garantir a condição adequada de transporte no meio de coleta de tecidos com uma caixa de transporte equipada com compressas frias a aproximadamente 4 °C.
- No laboratório, prepare os reagentes e equipamentos necessários para facilitar o processamento oportuno de amostras:
- Descongelar a matriz do extrato de membrana basal Tipo II (matriz BME 2) sobre gelo (aproximadamente 2 h).
- Preparar bisturis descartáveis, ferramentas de dissecção esterilizadas (tesouras e pinças) e pastilhas de filtro de 400 μm para tubos de 50 mL.
- Prepare um recipiente com uma pequena quantidade de azoto líquido para congelação rápida e um banho-maria pré-aquecido a 37 °C.
NOTA: Trabalhar dentro de uma capela de fluxo laminar de cultura celular.
- Lave bem o tecido fresco em uma placa de Petri em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (sem Ca++ e Mg++). Dentro da placa de Petri, fragmente o tecido usando bisturis descartáveis e/ou tesouras em pedaços pequenos de 3 a 5 mm.
- Separe o tecido obtido em três secções para os seguintes fins:
- Coletar tecido em tubos criogênicos. Transfira os tubos criogênicos para o recipiente preparado cheio de nitrogênio líquido para congelamento por choque.
- Coletar tecidos (2-3 mm) em recipiente histológico preenchido com formalina para fixação (24 h) e incorporá-los em parafina para coloração19,20.
- Além disso, homogeneizar o tecido antes da digestão enzimática. Maximizar a dissociação mecânica com bisturi e transferi-lo para um tubo de tecido de 50 mL.
NOTA: Certifique-se de que o tecido esteja sempre embebido em PBS durante a homogeneização para evitar o ressecamento do tecido.
- Combinar o tecido homogeneizado com uma mistura de digestão contendo PBS (sem Ca++ e Mg++), colagenase I (solução-mãe 5 U/μL, concentração final 1 U/μL) e um inibidor seletivo de ROCK1 e 2 (concentração final de 3 μM) (componentes listados na Tabela 1). Use 15 mL de mistura de digestão em um tubo de 50 mL para cada 2 cm3 do tumor.
NOTA: Material limitado (por exemplo, amostras de biópsia) requer apenas pequenas quantidades (aproximadamente 2-3 mL) de mistura de digestão para garantir a dissociação enzimática. - Para dissociação enzimática, incubar o tubo por 1,5 h em banho-maria a 37 °C. Realizar vórtices esporádicos e vigorosos (aproximadamente a cada 20 min por 10-15 s) para apoiar a dissociação mecânica.
- Após a incubação, adicionar 15 mL de meio de cultura basal frio++ ao tubo. Centrífuga 5 min a 300 × g.
- Após a remoção do sobrenadante, adicionar 5 mL de novo meio de cultura basal++. Coar a suspensão celular usando um filtro de 400 μm em um tubo fresco de 50 mL.
- Centrifugar por 5 min a 300 × g. Retire o sobrenadante e mantenha o pellet celular.
- Para a remoção de eritrócitos, adicione 5 mL de tampão de lise de células vermelhas (RBC) à pastilha celular. Incubar em banho-maria durante 5 min a 37 °C.
- Adicionar 5 mL de meio de cultura basal++ para inativação da lise. Centrifugar por 5 min a 300 × g. Adicionar 3 mL de meio de cultura basal++ ao pellet celular.
- Contar células viáveis após diluição 1:1 com solução corante de azul de tripano (por exemplo, 10 μL da amostra + 10 μL de solução corada de azul de tripano) em um contador automático de células ou manualmente em uma câmara de Neubauer.
- Calcule o número de células necessárias para a semeadura 3D direta. Para cada depósito tumoral, semeie em uma placa de formato de 48 poços pelo menos 2-3 poços por meio de câncer de ovário, o que corresponde a um total de 8-12 poços em uma matriz de semeadura (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Calcular 30.000 células para cada poço em uma gota de 25 μL de matriz BME Tipo 2. Opcionalmente, escolha um formato de 24 poços com 50 μL de matriz BME 2 e 50.000 células semeadas por poço.
- Semeando as células restantes em 2D (ver etapa 2.1.13).
- Pipetar a quantidade de meio de cultura basal++ em suspensão que contém o número total de células necessárias em um novo tubo e centrifugar por 5 min a 300 × g. Retire o sobrenadante e mantenha o pellet celular.
- No gelo, adicione a quantidade total de matriz fria de BME 2 (25 μL para cada poço em uma placa de formato de 48 poços; portanto, 100 μL para 4 poços) ao pellet e misture bem para obter uma distribuição uniforme de células por poço, pipetando suavemente o pellet para cima e para baixo sem criar bolhas.
- Semeando as células em gotículas da matriz BME 2 (25 μL) para a placa pré-aquecida e vazia de 48 poços. Para obter uma distribuição uniforme entre os poços, mova suave e lentamente a pipeta para cima e para baixo (3-4x) dentro do tubo antes de transferir a gotícula da matriz BME 2 para cada poço para evitar a precipitação celular durante a distribuição.
- Depois de incubar a placa a 37 °C por pelo menos 30 min para consolidar as gotículas da matriz BME 2, pipetar 250 μL de cada um dos quatro meios de câncer de ovário (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) nos poços correspondentes.
- Em paralelo ao procedimento de semeadura 3D direta, preservar as células isoladas remanescentes iniciando uma cultura 2D.
- Após centrifugação por 5 min a 300 × g, adicionar o pellet ao meio 2D. Selecionar o formato (frasco T75 ou frasco T25), dependendo do número de células disponíveis após a semeadura 3D.
- Incubar o balão durante 3-5 dias a 37 °C para adesão celular. Mantenha o mesmo meio durante as primeiras 72 h.
- Quando as células atingirem a confluência, transferir a cultura para a matriz BME 2. Não expanda isolados primários em cultura 2D dividindo-se, pois a propagação a longo prazo em 2D é prejudicial ao potencial de caule.
- Transferência da cultura 2D para a cultura 3D
- No frasco T75 ou T25, lavar a monocamada 2x com 5 mL de PBS para desprender as células da superfície inferior. Incubar com 1 mL de tripsina por 10 min a 37 °C.
- Adicionar 5 mL de meio de cultura basal frio++ para inativação do reagente de dissociação. Centrifugar por 5 min a 300 × g.
- Adicionar 3 mL de meio de cultura basal++ ao pellet. Conte as células conforme descrito nas etapas 2.1.12-2.1.13. Sementes para as diferentes composições dos meios (ver figura 1), conforme descrito nos passos 2.1.16-2.1.18.
- Avaliação do crescimento organoide
- Imagem dos poços pelo menos uma vez por semana para documentar o crescimento organoide. Faça imagens comparáveis de alta qualidade de cultura 2D/3D e placas de semeadura direta por microscópio de contraste de fase. Cuide da consistência na ampliação e use 4x para uma visão geral dos poços (quantificação) e 10x e 20x para documentar a morfologia dos organoides.
- Organize o armazenamento de imagens em pastas dedicadas a linhas individuais.
- Selecionar a melhor linhagem organoide para cultivo de longo prazo por meio da avaliação comparativa da formação de organoides nas diferentes modalidades de semeadura (2D seguida de semeadura 3D versus semeadura 3D direta) e diferentes composições de meios (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 e OCM2+ HER1ß).
- Em média, 14-21 dias após o isolamento, avaliar o potencial (quantidade) de formação de organoides, bem como o tamanho e o fenótipo celular dos organoides cultivados sob diferentes condições. Procure as seguintes características: ausência de vacúolos, branqueamento da membrana ou perda de aderência e arredondamento das células.
3. Cultivo de organoides a longo prazo
- Passaging organoide
- Evite dividir organoides com muita frequência e durante a fase proliferativa. Realizar procedimentos de digestão mecânica e enzimática com intervalos superiores a 10 dias.
- Para interromper cada gota de matriz BME 2, adicione 250 μL (formato de 48 poços) ou 500 μL (formato de 24 poços) de meio de cultura basal gelado++. Garanta a dissolução completa da gotícula e da pipeta intermitentemente para cima e para baixo e raspe o fundo da placa. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e coloque-a no gelo. Adicionar 1 mL de meio de cultura basal gelado++.
NOTA: A eficiência de remoção da matriz BME 2 depende fortemente da temperatura média, uma vez que a melhor dissolução é alcançada abaixo de 4 °C. - Piscina 2-3 técnica replicar poços para expansão uniforme. Centrifugar por 5 min a 300 × g. Inspecione o conteúdo da suspensão contra a fonte de luz para ver se o gel BME 2 ainda está visível. Retire o sobrenadante e repita a lavagem com um meio gelado se a matriz BME 2 ainda estiver visível.
- Incubar com 1 mL de tripsina (armazenada a 20-25 °C) em banho-maria a 37 °C por 7-10 min. Vórtice esporadicamente por 10 s para aumentar a dissociação. Inspecione o tubo periodicamente visualmente para ver se a dissociação está progredindo.
- Puxe a suspensão celular para cima e para baixo com uma seringa através de uma agulha com um tamanho que varia de 23 G a 27 G. Verifique se ainda há aglomerados de células grandes e repita o procedimento, se necessário.
NOTA: A fragmentação através de uma seringa é opcional e o tamanho da agulha depende da eficácia de dissociação necessária. Uma suspensão celular homogênea leva a uma distribuição uniforme entre os poços. - Adicionar 1 mL de meio de cultura basal frio++ para inativar a reação.
- OPCIONAL: Conte as células conforme descrito nas etapas 2.1.12-2.1.13 e decida a proporção de divisão para a passagem parental (por exemplo, poços 1:3).
- Centrifugar por 5 min a 300 × g. Remova o sobrenadante.
- Realizar a semeadura conforme descrito nas etapas 2.1.16-2.1.18 e aplicar o respectivo meio organoide ideal de câncer de ovário de acordo com a cultura de longo prazo já estabelecida. Mude o meio do câncer de ovário a cada 3-4 dias.
- Em caso de ruptura da gotícula da matriz BME 2 durante a mudança de meio, considere a ressemeadura sem digestão enzimática. Para evitar a interrupção da gota, conduza cuidadosamente o procedimento de troca de meio sem pipetar diretamente na gota da matriz BME 2. Além disso, evitar deixar uma quantidade excessiva de meio de cultura basal residual++ no pellet antes da diluição com a matriz BME 2 na etapa 2.1.16, pois isso pode afetar a fragilidade das gotículas.
- Criopreservação de organoides
OBS: Realizar criopreservação dos organoides durante a fase de proliferação na primeira semana após a passagem.- Interromper a gota da matriz BME 2 com meio de cultura basal gelado++ de acordo com o passo 3.1.2. Após centrifugação e descarte do sobrenadante conforme descrito na etapa 3.1.3., trabalhar sobre gelo e ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de criopreservação gelado. Transfira a suspensão celular para tubos criogênicos pré-marcados de 1,8 ml.
- Conservar os tubos num recipiente de congelação pré-arrefecido contendo álcool isopropílico e colocá-los a -80 °C durante a noite.
- Mantenha os tubos de estoque a -80 °C por no máximo 2 meses. Transferência para nitrogênio líquido para armazenamento estável a longo prazo.
- Descongelamento de estoques de organoides
- Pré-aquecer 9 mL de meio de cultura basal++ em banho-maria a 37 °C em tubo marcado de 15 mL.
- Transfira o frasco para injetáveis de reserva desejado do armazenamento a -80 °C ou para azoto líquido para um recipiente de transporte cheio de azoto líquido.
- Transfira o criotubo para banho-maria a 37 °C e agite-o suavemente até que o material congelado perto das paredes do tubo comece a descongelar.
- Distribuir lentamente a suspensão organoide no tubo marcado preenchido com 9 mL de meio. Agite suavemente o tubo. Centrifugar durante 5 min a 300 × g e retirar o sobrenadante.
- Realizar a semeadura conforme descrito nas etapas 2.1.16-2.1.18 e aplicar o respectivo meio organoide ideal de câncer de ovário de acordo com as condições de cultura de longo prazo já determinadas para a linhagem individual.
- Fixação de organoides
- Realizar a coleta de organoides conforme descrito nas etapas 3.1.2-3.1.3.
- Adicionar 3 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS (pH 7,4) e incubar por 1 h à temperatura ambiente.
- Lavar 2x com 5 mL de PBS, centrifugar por 3 min a 300 × g e retirar o sobrenadante. Adicionar 4 ml de PBS fresco ao pellet e mantê-lo a 4 °C até à incorporação.
NOTA: Os organoides fixos são estáveis e o armazenamento a 4 °C é possível durante 1 mês antes da incorporação. - Aquecer o gel histológico (armazenado a -20 °C) a 65 °C até ficar liquefeito.
- Detectar os organoides fixos assentados e visíveis no fundo do tubo. Remova o sobrenadante. Em caso de ruptura da pastilha celular, realizar centrifugação por 3 min a 300 × g e descartar o sobrenadante PBS.
- Suspender o pellet em 100 μL de gel quente, pipetando suavemente para cima e para baixo. Transfira a gota para um pedaço de filme de vedação e permita que a solidificação ocorra após ~15 min à temperatura ambiente.
- Mova a gota de gel fixa para o de parafina de tecido. Realizar protocolos padrão de incorporação tecidual 19,20.
- Corte fatias de 5-10 μm de espessura com uma ferramenta de corte de microsecção. Transfira os cortes para lâminas histológicas. Secar as lâminas por 1 h a 65 °C; Mantenha-os em local seco.
- Coloração por imunofluorescência de cortes organoides
- Mover as lâminas preparadas através de bandejas de vidro com a seguinte série de diluição: 2 x 15 min agente de limpeza para histologia; 15 min 100% etanol; 1 min 100% etanol; 10 min etanol 96%; 5 min etanol 70%; 5 min 50% etanol.
- Adicione PBS e mantenha 5 min no agitador a 100 rpm. Repita a lavagem 2x.
- Adicionar solução de recuperação de antígeno (tampão Tris(hidroximetil)aminometano-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) [pH 9,0] ou citrato [pH 6,0]) às lâminas que são colocadas na câmara termoestável. Em um vaporizador, mantenha o recipiente com as lâminas por 30 min, seguido de resfriamento até a temperatura ambiente.
- Repita a etapa 3.5.2.
- Transfira a câmara contendo as lâminas por 15 min para solução de detergente permeabilizante a 1% (em PBS).
- Repita a etapa 3.5.2.
- Contorne a localização dos organoides nas lâminas com uma caneta de cera imunomarcante para manter a gotícula durante os passos seguintes.
- Adicionar em cada lâmina 100 μL de soro a 10% num meio de diluição, dependendo da espécie do anticorpo secundário.
- Repita a etapa 3.5.2.
- Diluir os anticorpos primários num meio, levando a um volume final de 100 μL. Manter a 4 °C durante pelo menos 16 h numa bandeja de incubação/câmara de humidade.
- Repita a etapa 3.5.2.
- Diluir os anticorpos secundários em um meio, levando a gotículas de 100 μL, e manter por 2 h à temperatura ambiente em uma bandeja de incubação.
- Repita a etapa 3.5.2.
- Adicionar solução de contracoloração nuclear DAPI (4',6-Diamidin-2-fenilindol, dicloridrato) diluída num meio de diluição 1:1.000. Manter por 10 min em temperatura ambiente para incubação.
- Repita a etapa 3.5.2.
- Adicione o meio de montagem e cubra com a tampa. Prenda as lâminas com esmalte transparente uma vez seco (aproximadamente após 8-12 h).
- Imagem com microscópio confocal ou outro microscópio de fluorescência. Faça imagens de visão geral, bem como imagens detalhadas de estruturas subcelulares que capturam as principais características da morfologia organoide.
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Representative Results
Após dissociação, filtração e contagem inicial do tecido, as células são semeadas em paralelo diretamente no formato 3D, como explicado acima, bem como a suspensão no frasco para breve expansão 2D. Em alguns casos, a expansão 2D transitória influencia positivamente a formação do organoide, e a linha de longo prazo é estabelecida com sucesso por essa via, enquanto a semeadura 3D paralela comparativa pode resultar em parada de crescimento (Figura 1). Para cada tecido doador processado, as células são testadas de acordo com a matriz de meios. Seguindo essa estratégia, nosso biobanco agora contém linhas representativas de cada condição padrão de crescimento, como mostra a Figura 2. Através da implementação rigorosa desta mini plataforma de triagem de testes de diferentes meios e modos de semeadura, geramos com sucesso linhagens organoides de diferentes tipos histológicos e estágios de desenvolvimento da doença do câncer de ovário (Figura 3) de cirurgias primárias de alto grau serosas, pós-intervalo neoadjuvante e de doença recorrente. A caracterização fenotípica das linhagens organoides pela coloração por imunofluorescência dos principais marcadores em comparação com o tecido parental demonstra de forma convincente que as características do compartimento tumoral epitelial estão preservadas no modelo organoide: arquitetura epitelial e adesão marcada por (EpCAM), identidade de linhagem (PAX8) e mutação típica do ponto TP53 característica do HGSOC levando ao acúmulo no núcleo (Figura 4).
Alguns pontos metodológicos importantes também devem ser considerados para a tomada de decisão eficiente durante o biobanco de organoides. O potencial de crescimento organoide não é determinado apenas pelo aumento do diâmetro organoide. Além disso, características fenotípicas determinam potenciais de expansão, como cor, escuridão e integridade do contorno. A formação de vacúolos de estresse citoplasmático indica condições subótimas. Problemas iniciais com relação ao crescimento e potencial de formação de organoides podem ocorrer devido a condições inadequadas de transporte e atraso na procissão do tecido. Como uma alta variabilidade interindividual no potencial de expansão é observada dentro das linhagens tumorais, recomendamos aguardar pelo menos 14 dias antes de tomar uma decisão final sobre o potencial de crescimento. Se padrões de crescimento semelhantes forem inicialmente observados em diferentes meios, várias condições devem ser expandidas. Pela nossa experiência, uma distinção clara do potencial de crescimento estável a longo prazo só é muitas vezes possível após o cultivo de várias semanas ou meses.
Figura 1: Benefícios da semeadura breve em 2D de isolados primários para posterior geração de organoides. (A) Esquema do esquema experimental mostrando a estratégia de semeadura paralela bidirecional: 2D/3D e semeadura direta 3D em quatro meios diferentes. (B) Imagem de isolados primários aderentes antes da tripsinização e transferência 3D. (C) Um exemplo do depósito primário onde a semeadura paralela revelou a clara vantagem da rota 2D/3D como expansão organoide de longo prazo só foi possível a partir de progenitores que foram inicialmente isolados em plástico. A imagem superior esquerda mostra uma cultura 3D 7 dias após o isolamento na passagem 0 (referida como P0) com formação organoide insuficiente após a primeira passagem (referida como P1) na imagem inferior esquerda. Após a semeadura 2D em plástico (ver Figura 1B) seguida de transferência para uma cultura 3D, uma melhor formação organoide já é aparente em P0, enquanto o potencial de expansão a longo prazo é confirmado na passagem 4 (P4). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Necessidade de meio específico do paciente. Exemplos de quatro diferentes linhas expandidas estáveis de longo prazo, cada uma crescendo em um meio diferente. Barra de escala = 500 μm. Abreviações: OCM = meio de câncer de ovário; ela = heregulina 1β; HGSO = câncer seroso de ovário de alto grau. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geração de organoides de todos os estágios da doença. Imagens de linhas expansivas estáveis de longo prazo, de câncer de ovário seroso de alto grau e de baixo grau na apresentação da doença primária, de cirurgia de intervalo (quimioterapia pós-neoadjuvante) e de tecido canceroso recorrente. Barra de escala = 500 μm. Abreviações: HGSOC = câncer seroso de ovário de alto grau; LGSOC = câncer seroso de ovário de baixo grau; NACT = quimioterapia neoadjuvante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Correspondência estreita do fenótipo dos organoides e do tecido canceroso parental. Imagens confocais de coloração por imunofluorescência de (A) tecido canceroso e (B) linha organoide pareada mostram similaridade muito alta no padrão de coloração e nível de expressão de todos os marcadores, EpCAM (verde), PAX8 (vermelho), TP53 (magenta). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição do meio e mistura de digestão utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O protocolo projetado aborda os desafios anteriores do biobanco de organoides do câncer de ovário no que diz respeito à formação de organoides e ao potencial de passagem a longo prazo e garante a geração de linhas totalmente expansíveis a partir da maioria dos depósitos tumorais sólidos. O processo de coleta cirúrgica de amostras tumorais a serem utilizadas para geração de organoides impacta significativamente o rendimento e o potencial de expansão. Amostras de tecido tumoral podem ser obtidas durante vários procedimentos, incluindo cirurgia multivisceral, laparoscopia diagnóstica ou biópsia. O cirurgião gineco-oncológico experiente deve priorizar a obtenção de amostras limpas de tumores de localização peritoneal. Notavelmente, tem sido observado que áreas macroscopicamente necróticas dentro de grandes depósitos tumorais são menos adequadas para a geração bem-sucedida de culturas de organoides. Como a pureza da amostra é crucial para refletir características moleculares e fenotípicas para aplicações a jusante, esforços sincronizados das equipes clínica e laboratorial são necessários para o biobanco ideal, garantindo que as linhas sejam criadas a partir das regiões mais relevantes do tumor.
Embora este protocolo cubra as variações nas dependências dos fatores de crescimento que observamos durante 2 anos de biobanco, é claro que um refinamento adicional é necessário para aumentar ainda mais a eficácia, pois ainda não observamos nenhum crescimento organoide em 20% dos casos e o número de linhagens que demonstraram potencial de expansão limitado sugeriu manutenção subótima da haste. Embora nosso biobanco de organoides atualmente inclua apenas amostras de histologia serosa de câncer de ovário (HGSOC e LGSOC), nossa experiência com amostras de diferentes histologias de câncer epitelial de ovário antes do programa estruturado de biobanco exibiu taxas de sucesso comparáveis sem diferenças específicas. Notavelmente, a maioria dos subtipos de câncer epitelial de ovário compartilha uma morfologia pseudoestratificada colunar semelhante com tecidos que se desenvolveram a partir do trato mülleriano (tuba uteriana, útero, colo uterino), enquanto, em contraste, o próprio epitélio ovariano origina-se desenvolvimentalmente da crista genital e do mesonefro, sendo coberto por uma única camada de epitélio cuboidal. Uma vez que as vias de desenvolvimento que regulam a homeostase epitelial têm um papel central no controle do potencial das células-tronco adultas, as diferenças na origem embrionária devem ser levadas em consideração no desenvolvimento de protocolos para biobanco de organoides. Assim, acreditamos que progenitores da superfície do ovário provavelmente requerem condições de cultura órgão-específicas para sustentar o crescimento estável a longo prazo.
Notavelmente, em nosso laboratório, o protocolo provou ser bem-sucedido também para amostras de câncer de ovário pós-neoadjuvante, embora a quimioterapia neoadjuvante impacte a viabilidade celular e o fenótipo tecidual. Essas amostras exibem mais debris e agregados de tecido extracelular em comparação com amostras derivadas de tecido virgens de quimioterapia de cirurgias primárias de debulking, o que poderia afetar o potencial de formação de organoides. Nesses casos, observamos que uma quantidade adequada de tecido cirúrgico e uma aderência rigorosa às condições de transporte recomendadas são cruciais para o sucesso da geração de organoides, uma vez que as amostras pós-neoadjuvantes podem ser mais sensíveis.
Um fenômeno muito interessante do efeito benéfico da breve expansão sobre o plástico em 2D de progenitores recém-isolados sobre o crescimento organoide subsequente, que temos observado repetidamente e, portanto, incluído no procedimento experimental padronizado, é uma adição importante à metodologia do campo de pesquisa de organoides do câncer, que depende em grande parte de estratégias diretas de semeadura. É tentador especular que a sensibilidade dos progenitores após a digestão enzimática e a capacidade dos fatores de crescimento de prepará-los adequadamente poderiam ser os mecanismos subjacentes por trás dessa diferença, que é, em alguns casos, um fator decisivo se a linha puder ser estabelecida. No entanto, mais pesquisas são necessárias para estabelecer dependências claras.
Ao enfrentar os desafios impostos pela alta adesão celular e junções funcionais em organoides de câncer de ovário 3D, que são difíceis de digerir, uma combinação de dissociação mecânica e enzimática com agulha e seringa pode ajudar quando grandes aglomerados permanecem após a tripsinização. Experimentar diferentes condições enzimáticas pode levar a melhorias adicionais.
Após o armazenamento a longo prazo, as linhagens organoides podem ser descongeladas e trazidas para a cultura de acordo com o planejamento experimental e usadas para aplicações subsequentes. Isso permite o acesso, a qualquer momento, a linhas organoides já geradas para fins específicos de pesquisa e é particularmente interessante para investigar o comportamento a longo prazo de certas linhas à luz da progressão da doença do paciente. No entanto, a criopreservação de organoides do câncer de ovário permanece um desafio. Variações de temperatura durante os ciclos de congelamento e descongelamento podem afetar negativamente a viabilidade dos organoides, a funcionalidade e o potencial de expansão. O armazenamento a longo prazo é mais estável em nitrogênio líquido, onde temperaturas muito baixas minimizam o risco de degradação para que a integridade dos organoides possa ser mantida. No entanto, a otimização contínua é necessária para estabelecer procedimentos consistentes de congelamento, armazenamento e descongelamento, para melhorar ainda mais esses processos.
Apesar das questões pendentes mencionadas, este protocolo demonstra a capacidade de gerar consistentemente linhagens organoides estáveis a partir de amostras de tumores sólidos de pacientes com câncer de ovário. Em nosso laboratório, processamos até o momento 120 amostras de tecido primário de câncer de ovário, obtendo sucesso em aproximadamente 50% dos casos, incluindo uma ampla gama de subtipos histológicos e estágios da doença com debulking primário, doença recorrente e espécimes cirúrgicos pós-neoadjuvantes. Ao fornecer uma estrutura estruturada para a geração de organoides derivados de várias amostras de pacientes, semeadura paralela em diferentes meios e implementação de diferentes estratégias de semeadura, este protocolo fornece uma oportunidade para avaliar diferenças individuais no potencial de haste, fornecendo assim informações adicionais sobre a biologia tumoral. Até onde sabemos, a grande maioria dos estudos geralmente segue a abordagem inversa de testar os componentes médios em um pequeno número de amostras e escolher por simplicidade principalmente um meio ótimo. Nosso teste sistemático do efeito de HER1ß, o efeito da suplementação de RSPO1 e FGF10 e a semeadura 2D/3D demonstra conclusivamente que o tecido de câncer de ovário tem um grau de variabilidade interpaciente nas propriedades do tronco, e o meio ideal é realmente específico para o paciente. Portanto, testes paralelos sistemáticos de diferentes composições de meios fornecendo diferentes ambientes exógenos de sinalização parácrina são essenciais.
O estabelecimento de um biobanco vivo com um extenso painel de organoides derivados de várias pacientes com câncer de ovário, juntamente com suas informações clínicas coletadas prospectivamente, serve como um recurso valioso para uma ampla gama de aplicações de pesquisa e reflete o cenário clínico heterogêneo que é potencialmente aplicável a uma população maior de pacientes17. O cultivo a longo prazo e a criopreservação permitem a consistência experimental e a acessibilidade repetida da mesma linha organoide ao longo do tempo, servindo de base para desenhos experimentais longitudinais com propriedades celulares inalteradas da linhagem tumoral.
Por reter a arquitetura epitelial e a polarização, as linhagens organoides são um modelo adequado para estudar a comunicação célula-célula e a tomada de decisão de destino celular dependente do contexto, mediada por vias de sinalização parácrinas. A incorporação dos organoides no gel histológico é uma etapa intermediária prática e eficiente para evitar a perda de material pós-fixação e garante que o processamento a jusante (incorporação em parafina e secção) possa ser realizado em paralelo com amostras de tecido. A perda de organoides durante o procedimento de fixação é uma questão crítica quando o número de organoides é muito limitado. No entanto, essa perda pode ser compensada removendo completamente os organoides da matriz extracelular por lavagem em meio de cultura basal frio e agrupando pelo menos dois poços adultos de uma placa de formato de 24 poços antes da fixação. O protocolo de coloração por imunofluorescência permite que imagens confocais de alta resolução correspondam características moleculares e fenotípicas dos organoides do câncer de ovário com o tecido tumoral parental, mas também é uma ferramenta valiosa para estudar a resposta celular a compostos químicos ou caracterização de linhagens geneticamente modificadas. O método também é adequado para coloração histológica sem modificações específicas. Dependendo do objetivo do estudo, cortes mais finos cortados com micrótomo (2-3 μm) devem ser considerados.
É importante ressaltar que a cultura estável de longo prazo é um pré-requisito para experimentos de edição gênica e ensaios funcionais sobre resposta a drogas e resistência a terapias novas e padrão17,21. Em particular, organoides gerados a partir de rebiópsias realizadas durante a progressão da doença e recidiva oferecem a possibilidade de análises comparativas diretas entre o tumor original virgens de terapia e as características recém-adquiridas observadas durante a recidiva. A identificação de respostas ao tratamento específico do paciente e a formação de resistência terapêutica in vitro avançam o campo da medicina de precisão na pesquisa do câncer de ovário21.
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Disclosures
M.K. está listado como um inventor em uma patente relacionada a um meio para organoides de câncer de ovário. F.T. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários e despesas de viagem da AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA e Tesaro/GSK. S.M. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários ou despesas de viagem: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
O estudo é financiado pelo Centro Alemão de Pesquisa do Câncer DKTK, parceiro de Munique, uma parceria entre a DKFZ e o Hospital Universitário LMU de Munique. O estudo também é apoiado pela bolsa alemã Cancer Aid (#70113426 e #70113433). A incorporação de parafina de tecidos e organoides foi realizada nas instalações do núcleo do Instituto de Anatomia, Faculdade de Medicina, LMU Munique, Munique. A Imagem Confocal foi realizada na instalação Core Bioimaging no Centro Biomédico (BMC). Os autores agradecem a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink e Martina Rahmeh pela ajuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
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