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Biology

制备热塑性微流体通道

doi: 10.3791/664 Published: February 3, 2008

Summary

在这里我们将演示如何制造热塑性微流体芯片采用热压成型和热封。然后,我们将演示如何使用通过密封芯片执导的原位光接枝表面和聚合,形成的复合材料的固相柱。

Abstract

在我们的实验室,我们已经成功地分离出核酸,直接从人体的血液,尿液和大便使用聚合物/纳米粒子复合材料的微观溶解和固相萃取柱微升和submicroliter卷。回收的样本PCRable无需任何额外的清理,集中,小体积样品。在这里,我们将演示如何制造热塑性微流体芯片采用热压成型和热封。然后,我们将演示如何使用通过密封芯片执导的原位光接枝表面和聚合,形成的复合材料的固相柱。我们展示嫁接和碳纳米管/聚合物复合列细菌细胞裂解聚合。然后,我们显示芯片采用硅/聚合物复合材料柱从样品核酸的固相萃取的裂解过程。所附的协议包含如何使裂解和固相萃取柱的详细说明。

Protocol

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制造微流体通道在一个循环的聚烯烃(Zeonex ® 690R,吉恩化工有限公司,路易斯维尔,肯塔基州)。 Zeonex有136℃的玻璃化转变温度(Tg)和紫外线透明的,这是光在巨石形成多孔的用于化学至关重要。微结构微热压印一个尼科电铸主模,它具有负(反)微流体平台的功能。热压印完成如下:

  1. 模具和聚合物衬底之间放置两个平行的金属压板。
  2. 该压板加热压花温度(166℃), ​​这是30 º C以上的Zeonex Tg。
  3. 的压板,然后同时按下约5分钟,并保持在250磅的压力。
  4. 模具与基板,然后取出从加热盘,让其冷却1-2分钟,然后手动相互分离。
  5. 1.5毫米直径的井钻探样品的引进和收集渠道的两端。
  6. 压纹塑料基板,然后用另一块的Zeonex热粘合,形成封闭的微流体通道。浮雕基材和覆盖件可紫外臭氧或热粘合前处理,以提高密封效率和确保封闭的渠道结构(巴塔和Klapperich,2007年)的保真度的等离子体。

塑料微流体通道内固相萃取(SPE)柱的制备

固相制备是一个两步的过程。起初,编造微表面改性的塑料装置,以提高固相萃取柱的附着力。通过表面聚合接枝是用于功能化的聚合物微通道的墙壁。

嫁接过程如下:

  1. 微充满了1:1的混合物的环氧丙烯酸酯(EDA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)用3%的二苯甲酮,这是一个抽象的光引发剂的氢。 EDA,甲基丙烯酸甲酯和二苯甲酮均购自Sigma - Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州。
  2. 然后,该芯片是紫外线照射,在254 nm紫外线波长和紫外线照射仪(CL - 1000紫外交联剂,UPV公司,高地,加州)200兆焦耳 /厘米2的能量为10分钟。嫁接发生拴表面的聚合物链,获得的庞然大物在第二步准备使用的聚合混合物中通过的H -抽象的聚合和结果。
  3. 从通道中删除多余的单体与15μL甲醇使用真空抽吸冲洗。

后接枝过程中,微孔聚合​​物巨石形成的微通道内,坑害二氧化硅粒子对DNA的提取。 多孔的一块准备在原地如下:

  1. 表面改性的通道都充满了一个庞然大物的易制毒化学布玛(15%WT),EDMA(10%WT),1 - 十二醇(52.5%WT),环己醇(22.5%WT),DMPAP组成的混合物(1%WT与尊重单体)和0.7微米的二氧化硅微粒(尊重的预聚物的混合物总量的15%)。硅胶微球均购自Polysciences,公司(睡眠PA)和Sigma - Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州购买的单体和porogenic溶剂。
  2. 该芯片是与紫外线紫外线交联剂照射在200兆焦耳/厘米2为1.1分引发聚合,从通道中删除多余的单体与15μL甲醇使用真空抽吸冲洗。
  3. (NanoPorts TM连接,厄普丘奇科学,橡树港,WA)流体连接,然后附着在微流体通道的引进和集水井。
  4. 多孔的一块,然后再与甲醇洗涤使用注射泵流量的100mL/hour至少30分钟。

北海裂解一枝独秀制作塑料微流体通道内

制备的CNT(碳纳米管)裂解庞然大物是一个两步的过程。首先,制造微表面改性(嫁接),在同样的方式在塑料设备的SPE柱。

后接枝过程中,形成微孔聚合物一枝独秀内的多壁碳纳米管浸渍微。 多孔的一块准备在原地如下:

  1. 多壁碳纳米管悬浮在环己醇在2.27M的浓度。这再悬浮超声在50%幅度为30分钟和一个sonifier细胞干扰物(50%占空比Sonifier的S - 250丹伯里,必能信超声,CT)的研发,制造的。超声提供了碳纳米管的有效和稳定的0.5M的悬浮液。 Nanolabs(布赖顿,马萨诸塞州)均购自碳纳米管。
  2. 除了现在的环己醇的解决方案+使用碳纳米管是表面改性通道都充满了类似的巨石前体的混合物。一枝独秀的混合物组成的布玛(15%WT),EDMA(10%WT),1 - 十二醇(52.5%WT),环己醇+碳纳米管(22.5%WT)。此解决方案添加光引发剂DMPAP(1.13%的单体重量)。单体,porogenic溶剂和DMPAPA均购自Sigma - Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州。
  3. 该芯片是在120兆焦耳/ 厘米 2照射紫外线紫外线交联剂为0.9分钟,引发聚合。该设备是180度翻转的crossliker,另一个在120兆焦耳/平方厘米0.9分钟照射。从通道中删除多余的单体与50μL甲醇使用真空抽吸冲洗。
  4. (NanoPorts TM连接,厄普丘奇科学,橡树港,WA)流体连接,然后附着在微流体通道的引进和集水井。

北海裂解一枝独秀使用的细菌样品制备

一种细菌样品的样品制备涉及到在600nm处的光密度测量,以确保该样本是不是非常集中,以免堵塞通道。

  1. 在与媒体的细菌600nm处的OD读数,这是一个分光光度计(Eppendorf公司分光光度计,科学的Eppendorf公司,韦斯特伯里,纽约州)。稀释样品,直到OD值下降的范围内0.18-0.25答:
  2. 在5分钟6500转离心样品,倒出上清液。

裂解

  1. GuSCN悬浮细菌* + .01%SDS + 4%,蛋白酶K(0.8mg/ml)。涡简要(媒体细菌1毫升应悬浮1毫升GuSCN)。蛋白酶K被添加到解决方案援助变性,附着细菌的DNA和蛋白质抑制DNAases和RNAases。蛋白酶K的一个额外的好处是,它也打破细胞壁的蛋白质,这是可取的,因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中含有大量的蛋白质(虽然革兰氏阴性菌通常有更多的蛋白质艾滋病)。此外,离液剂缓冲区艾滋病的蛋白酶K与变性的蛋白质,而洗涤剂破坏细胞壁。蛋白酶K和胍硫氰酸盐(GuSCN)均购自Qiagen公司(瓦伦西亚,加利福​​尼亚州)。 SDS(​​十二烷基硫酸钠)购自皮尔斯(罗克福德,IL)。
  2. PEEK管连接到一个注射器,立即装入样品。使系统在没有空气吸入注射器。连接管nanoport和渠道。

一个KDS100注射泵(Holliston,马KD科学,制造)用于实验和使用的流量为450μL/小时的所有步骤。流450ul/hr样品裂解通道。

  1. 收集样品,并继续通过SPE提取DNA(DNA提取协议)。注意:这种细菌样本不会需要遵循载荷步2,自暂停GuSCN *.

DNA的提取协议

提取过程包括3个步骤:

  1. 负载。
  2. 华盛顿州
  3. 流出。

KDS100注射泵(Holliston,马KD科学,制造)用于实验和使用的流量为300μL/小时的所有步骤。

负载

  1. 条件通道离液剂缓冲区(GuSCN *,硫氰酸胍)在实验开始前1-2分钟。
  2. 在离液剂缓冲液按1:1的比例混合样品。
  3. 3分钟的通道流过样品的混合物。

  1. 洗2分钟与70%乙醇的通道。
  2. 洗净与100%乙醇2分钟的渠道。

洗脱

  1. 3分钟的微孔水洗脱提取的DNA。收集15μL纯化,DNA PCR准备。

* GuSCN从Qiagen公司试剂盒(缓冲区RLT)。

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References

  1. Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices. Lab Chip. 7, 876-882 (2007).
制备热塑性微流体通道
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Bhattacharyya, A., Kulinski, D., Klapperich, C. Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels. J. Vis. Exp. (12), e664, doi:10.3791/664 (2008).More

Bhattacharyya, A., Kulinski, D., Klapperich, C. Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels. J. Vis. Exp. (12), e664, doi:10.3791/664 (2008).

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