Summary
זה וידאו פרוטוקול להדגים כיצד השתל מכוסה זכוכית חלון גולגולתי במכרסמים. תכשירים אלה יכולים לשמש כרונית in vivo שני הפוטונים הדמיה של הניאוקורטקס על סולמות זמן של חודשים. זה יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של הדמיה, כולל הדמיה אופטית אות מהותי.
Abstract
טכניקות ההדמיה נעשים יותר ויותר חשוב בתפקוד המוח במחקר. ביניהם, שני הפוטונים מיקרוסקופ סורק לייזר התפתחה שיטה שימושית מאוד, משום שהיא מאפשרת את המחקר של המוח שלמים לחיות. עם ההכנות המתאימות, טכניקה זו מאפשרת תצפית באזור קליפת המוח באותו כרוניים, מ דקות עד חודשים. בסרטון הזה, אנו מראים הכנה כרונית בתחום ההדמיה vivo של המוח באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. טכניקה זו היה בתחילה חלוץ ידי דר 'קארל סוובודה, כיום הווארד יוז רפואי חוקר במכון Janelia משק חקלאי. תכשירים כמו זה המוצג כאן יכול לשמש הדמיה של המבנה neocortical (למשל, הדינמיקה הדנדריטים axonal), להקליט הפעילות העצבית באמצעות סידן רגיש צבעים, אל קליפת המוח תמונה הדינמיקה זרימת הדם, או מהותי לימודי הדמיה אופטית. הדמיה של דיפ הניאוקורטקס אפשרי עם אופטימלית ניתוחים חלון גולגולתי. הפעלה בתנאים סטריליים ביותר האפשרית כדי למנוע זיהומים, יחד עם שימוש זהירות רבה, כדי לא לגרום נזק מאטר הדורה במהלך הניתוח, תגרום מכוסה זכוכית החלונות מוצלחת וארוכת טווח גולגולתי.
Protocol
- הרדימי עכברים עם isoflurane (4% לזירוז, 1.5-2% לניתוח) באמצעות נהלים שאושרו IACUC. חשוב זנב ו / או צובט את הבוהן משמשים על מנת להבטיח את החיה הוא מסומם לגמרי.
- שימוש גוזם מכרסם, לגלח את השיער מהחלק האחורי של הצוואר עד העיניים.
- מניחים את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic, על שמיכה מים מחדש במחזור הניתוח. לאבטח היטב את הראש עם ברים האוזן.
- החל משחה העין, על מנת למנוע עין של החיה מהתייבשות.
- ניהול, תת עורי, dexamethasone (0.2 מ"ג / ק"ג) ו Carprofen (5 מ"ג / ק"ג) כדי למנוע התנפחות של המוח ו / או תגובה דלקתית, בהתאמה.
- לפני תחילת הניתוח, לחטא את אזור ההפעלה ידי ניגוב העור עם שלושה swipes לסירוגין של אלכוהול 70% ו בבטאדין.
- כל המכשירים כירורגית כבר מראש לעקר באמצעות מעקר חרוז זכוכית. באמצעות מספריים שהיו מעוקרות עם אתנול, להסיר את העור מעל הגולגולת, החל לחתוך אופקי לאורך כל הבסיס של הראש, ואחריו שני חתכים לכיוון מקורי, כמעט והגיע העפעפיים, ואז שני חתכים אלכסוניים כי להתכנס בבית קו האמצע.
- ירידה של פתרון + אפינפרין לידוקאין מוחל בשלב זה על periosteum כדי למנוע דימום מוגזם או כאב. עם אזמל, לסגת periosteum את הקצוות של הגולגולת. כמו כן, קל לחזור על שרירי הגב של הצוואר.
- לגרד בעדינות את האזור כולו חשוף של הגולגולת עם אזמל כדי ליצור משטח יבש. זה חשוב מאוד, שכן הוא יאפשר הדבק לדבוק טוב יותר כאשר מיושם מאוחר יותר.
- ברגע אתר הדמיה נבחרה, אחד הוא מוכן ליצור את החלון גולגולתי. ראשית, בעדינות "למשוך" מעגל של כ - 4 מ"מ קוטר עם המקדחה פנאומטי שיניים.
- לאחר קידוח קלה, להחיל לידוקאין + פתרון אפינפרין שוב על פני השטח את הגולגולת. הפסיקו את הקידוח כאשר שכבה דקה מאוד של העצם נשאר. על ידי לחיצה בעדינות על מרכז craniotomy כדי להרגיש איך זה נותן דרך, אפשר בדרך כלל יודעים כי בשלב זה הוא הגיע.
- תחת ירידה של יתרון מליחים לקיחת trabeculae העצם - המבנה הספוגי של העצם - להרים משם את craniotomy מהגולגולת עם מלקחיים קצה דק מאוד. מלח חשוב, כמו זה יעזור להרים את הגולגולת למנוע דימום של הדורה.
- החל Gelfoam כי כבר ספוג בעבר מלוחים מאטר הדורה לעצור דימום קטן מדי פעם מתרחשת כאשר הגולגולת מוסר.
- לאחר ייבוש השטח מאטר הדורה ולהבטיח כי יש דימום לא, בעדינות להניח כוס סטרילית 5 מ"מ לכסות להחליק על גבי מאטר הדורה. (הערה: קבוצות אחרות גם מקום ירידה של נקודת התכה נמוכה agarose (1.2%) מעל הדורה ולשים את coverslip על גבי אגר).
- החל טיפת דבק cyanocrylate מבוסס בחצי הכדור ההפוך על הגולגולת. בעזרת מחט, בעדינות להחיל את הדבק מסביב לחלון תוך הקפדה לא לשים אותו תחת זכוכית. דבק כעת ניתן להחיל בשכבה דקה על פני השטח הכולל של הגולגולת.
- לאחר הדבק התייבש, לערבב אקרילי שיניים ולהחיל אותו בכל השטח הגולגולת, המכסה גם שפה קטנה של להחליק את המכסה, כדי לאבטח אותו.
- לאחר הבטחת כיסוי להחליק, לבצע גם קטן סביב החלון עם אקריליק שיניים. כמו כן, להטביע בר טיטניום אקריליק שיניים. בר זה יהיה מאוחר יותר לשמש כדי לצרף את העכבר בבטחה לשלב של המיקרוסקופ הדמיה. חשוב להבטיח כי הבר ברמה, כך שיהיה מקביל עם החלון גולגולתי. הנחת פיסת נייר מתחת לבר יכולים להרשות הבר להישאר ברמה תוך אקרילי מתקשה.
- אקריליק שיניים מותר לרפא (להקשות) למשך 10 דקות, ועד אז הבר טיטניום קבוע במקום. מניחים את חיה בכלוב חמים עד שהוא מתאושש.
- לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, החיה ניתן הדמיה באותו יום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שהראינו את הוידאו וגם את הדמויות משלים, הכנת חלון גולגולתי, בשילוב עם שימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים, הוא כלי רב עוצמה מאוד ללמוד in vivo את המבנה והתפקוד של הניאוקורטקס. הטכניקה דורשת הכשרה קפדני להכיר את האנטומיה הרלוונטית ואת ניתוחים בסדר ומיומנויות כי זה דורש הכנה. רק ניתוחים וטהור יכול לשמש הדמיה כרונית. אם הדורה היא מניפולציה מוגזמת או ניקב, ההכנה לא אמור לשמש עבור דימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl) | Drug | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| Dexamethasone | Drug | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet Powder | Reagent | LANG | To be mixed with the acrylic | |
| Jet-Acrylic Liquid | Reagent | LANG | To be mixed with Ortho-Jet Powder | |
| Round Glass Cover Slip | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 5 mm diameter |
| Gelfoam | Surgery | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Titanium bars are custom-made | ||||
References
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
