Summary
यह वीडियो और प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कैसे एक गिलास कवर कृन्तकों में कपाल खिड़की समाविष्ट करने के लिए. ये तैयारियाँ दो photon महीने के समय के तराजू पर neocortex के इमेजिंग vivo में जीर्ण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी इमेजिंग ऑप्टिकल आंतरिक संकेत इमेजिंग सहित अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
इमेजिंग तकनीक के अध्ययन मस्तिष्क समारोह में तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं. उनमें से दो फोटोन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी एक अत्यंत उपयोगी तरीका के रूप में उभरा है, क्योंकि यह जीना बरकरार मस्तिष्क के अध्ययन की अनुमति देता है. उचित तैयारी के साथ, इस तकनीक का एक ही cortical क्षेत्र के अवलोकन लंबे समय की अनुमति देता है मिनट से महीने के लिए. इस वीडियो में, हम दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मस्तिष्क के vivo इमेजिंग में जीर्ण के लिए एक तैयारी दिखाते हैं. इस तकनीक शुरू डा. कैरेल SVOBODA, जो अब फार्म Janelia एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है ने बीड़ा उठाया है. यहाँ दिखाया गया है एक तरह तैयारी neocortical संरचना (उदाहरण के लिए, वृक्ष के समान और axonal गतिशीलता), इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों का उपयोग, छवि cortical रक्त प्रवाह की गतिशीलता के लिए, या आंतरिक ऑप्टिकल इमेजिंग अध्ययन के लिए neuronal गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं. Neocortex के दीप इमेजिंग इष्टतम कपाल विंडो सर्जरी के साथ संभव है. सबसे बाँझ संक्रमण से बचने के संभव शर्तों के तहत आपरेटिंग, चरम देखभाल का उपयोग करने के लिए सर्जरी के दौरान dura मेटर नुकसान नहीं के साथ साथ, सफल और लंबे समय से स्थायी गिलास कवर कपाल खिड़कियों में परिणाम देगा.
Protocol
- Anesthetize isoflurane साथ चूहों (प्रेरण के लिए 4%, शल्य चिकित्सा के लिए 1.5-2%) IACUC अनुमोदित प्रक्रियाओं का उपयोग. यह महत्वपूर्ण है कि पूंछ और / या पैर की अंगुली pinches क्रम में करने के लिए सुनिश्चित जानवर पूरी तरह से बेहोश है उपयोग किया जाता है.
- एक कृंतक trimmer का प्रयोग, गर्दन के पीछे से आंखों को बाल दाढ़ी.
- एक stereotaxic फ्रेम में एक सर्जरी पानी फिर से परिसंचारी कंबल पर माउस प्लेस. मजबूती कान सलाखों के साथ सिर सुरक्षित.
- आँख मरहम लागू क्रम में बाहर सुखाने से जानवर की आंखों को रोकने है.
- Subcutaneously, प्रशासन (0.2 मिलीग्राम / किलोग्राम) Dexamethasone और Carprofen (5 मिलीग्राम / किलोग्राम) मस्तिष्क और / या एक सूजन प्रतिक्रिया की सूजन को रोकने के लिए, क्रमशः.
- सर्जरी शुरू करने से पहले, 70% शराब और betadine के तीन बारी swipes के साथ त्वचा पोंछते द्वारा ऑपरेटिंग क्षेत्र बाँझ.
- सभी शल्य चिकित्सा उपकरण एक गिलास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग किया गया है पूर्व निष्फल. कि इथेनॉल के साथ निष्फल गया है कैंची का प्रयोग, खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को हटाने के लिए, सभी सिर के आधार के साथ एक क्षैतिज कटौती, व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में दो कटौती, लगभग पलकें तक पहुँचने, फिर दो परोक्ष कटौती द्वारा पीछा के साथ शुरू कि midline पर एकाग्र है.
- Lidocaine + एपिनेफ्रीन समाधान की एक बूंद periosteum पर इस बिंदु पर लागू होता है अत्यधिक खून बह रहा है या दर्द से बचने के. एक स्केलपेल के साथ खोपड़ी के किनारों को periosteum वापस लेना. इसके अलावा, हल्के से गर्दन के पीछे की मांसलता को वापस लेना.
- धीरे स्केलपेल के साथ खोपड़ी के पूरे उजागर क्षेत्र का परिमार्जन करने के लिए एक सूखी सतह बनाने के लिए. यह बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में यह गोंद बेहतर पालन करने के लिए अनुमति देते हैं जब बाद में लागू किया जाएगा.
- एक बार एक इमेजिंग साइट चुना गया है, एक कपाल विंडो बनाने के लिए तैयार है. सबसे पहले, धीरे न्युमेटिक दंत ड्रिल के साथ व्यास में लगभग 4 मिमी एक चक्र "आकर्षित".
- एक मामूली ड्रिलिंग के बाद, lidocaine + एपिनेफ्रीन समाधान फिर से लागू खोपड़ी की सतह पर. जब हड्डी का एक बहुत पतली परत छोड़ दिया है ड्रिलिंग बंद करो. Craniotomy के केंद्र पर लगता है कि यह कैसे रास्ता देती है धीरे धक्का करके, एक आम तौर पर पता है कि इस चरण में पहुंच सकता है.
- हड्डी के चिमड़ा संरचना - हड्डी trabeculae के खारा और ले लाभ की एक बूंद के तहत दूर बहुत पतली टिप संदंश के साथ craniotomy लिफ्ट खोपड़ी से. खारा महत्वपूर्ण है, के रूप में यह मदद मिलेगी खोपड़ी लिफ्ट और dura के खून बह रहा रोकने के.
- Gelfoam कि पहले किया गया है dura मेटर खारा है कि कभी कभी होती है जब खोपड़ी निकाल दिया जाता है किसी भी छोटे से खून बह रहा बंद में भिगो लागू करें.
- Dura मेटर सतह सुखाने और सुनिश्चित करना है कि वहाँ कोई खून बह रहा है के बाद, धीरे से एक बाँझ 5 मिमी dura मेटर के शीर्ष पर गिलास को कवर पर्ची करना. (नोट: अन्य समूहों को भी कम dura पर गलनांक agarose (1.2%) की एक बूंद जगह है और अगर के शीर्ष पर coverslip डाल) .
- खोपड़ी पर विपरीत गोलार्द्ध cyanocrylate आधारित गोंद के एक बूंद लागू करें. एक सुई की मदद के साथ, धीरे से खिड़की के आसपास गोंद लागू करते हुए सावधान किया जा रहा कांच के तहत नहीं डाल यह करने के लिए. गोंद अब खोपड़ी की पूरी सतह पर एक पतली परत में लागू किया जा सकता है.
- एक बार गोंद सूख गया है, दंत एक्रिलिक मिश्रण और यह खोपड़ी की सतह भर में लागू भी कवर पर्ची के एक छोटे से रिम को कवर है, इसे सुरक्षित.
- कवर पर्ची हासिल करने के बाद, दंत एक्रिलिक के साथ खिड़की के चारों ओर एक छोटी सी अच्छी तरह से बनाते हैं. इसके अलावा, दंत ऐक्रेलिक में एक टाइटेनियम बार एम्बेड. इस बार के बाद इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप की अवस्था पर माउस सुरक्षित संलग्न करने के लिए उपयोग किया जाएगा. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि बार स्तर है, इसलिए है कि यह कपाल खिड़की के साथ समानांतर है. पट्टी के नीचे एक कागज का टुकड़ा रखकर पट्टी स्तर रहने के लिए जबकि ऐक्रेलिक और मज़बूत बनाता है की अनुमति कर सकते हैं.
- दंत ऐक्रेलिक 10 मिनट के लिए इलाज (कठोर) की अनुमति दी है, जिसके द्वारा समय टाइटेनियम पट्टी में जगह तय हो गई है. एक गर्म पिंजरे में पशु प्लेस जब तक यह ठीक है.
- संज्ञाहरण से वसूली के बाद, पशु एक ही दिन पर imaged किया जा सकता है.
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Discussion
जैसा कि हम वीडियो में और अनुपूरक आंकड़े, कपाल विंडो तैयारी, दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ संयुक्त में पता चला है, और neocortex की संरचना और समारोह के vivo में अध्ययन के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण है. तकनीक प्रासंगिक शारीरिक रचना और ठीक शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और कौशल है कि इस तैयारी की आवश्यकता के साथ परिचित बनने के कठोर प्रशिक्षण की आवश्यकता है. केवल प्राचीन सर्जरी पुरानी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि dura जरूरत से ज्यादा या हवा निकाल चालाकी से है, तैयारी इमेजिंग के लिए प्रयोग नहीं किया चाहिए.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl) | Drug | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| Dexamethasone | Drug | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet Powder | Reagent | LANG | To be mixed with the acrylic | |
| Jet-Acrylic Liquid | Reagent | LANG | To be mixed with Ortho-Jet Powder | |
| Round Glass Cover Slip | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 5 mm diameter |
| Gelfoam | Surgery | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Titanium bars are custom-made | ||||
References
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
