Summary
Cette vidéo et le protocole de montrer comment implanter une verrière fenêtre crânienne chez les rongeurs. Ces préparations peuvent être utilisées pour les maladies chroniques in vivo à deux photons imagerie du néocortex des échelles de temps de plusieurs mois. Il peut également être utilisé pour d'autres types d'imagerie, y compris l'imagerie signal optique intrinsèque.
Abstract
Les techniques d'imagerie sont de plus en plus important dans le fonctionnement du cerveau étude. Parmi eux, microscopie à deux photons laser à balayage a émergé comme une méthode extrêmement utile, car elle permet l'étude du cerveau vivre intacte. Avec une préparation appropriée, cette technique permet l'observation de la même zone corticale chronique, de quelques minutes à plusieurs mois. Dans cette vidéo, nous montrons une préparation pour l'imagerie in vivo chroniques du cerveau en utilisant microscopie à deux photons. Cette technique a été initialement mis au point par le Dr Karel Svoboda, qui est maintenant un Howard Hughes Medical Institute à Janelia ferme. Les préparatifs comme celui illustré ici peut être utilisé pour l'imagerie de la structure du néocortex (par exemple, la dynamique dendritiques et axonales), pour enregistrer l'activité neuronale en utilisant des colorants sensibles au calcium, à l'image dynamique du flux sanguin cortical, ou pour les études d'imagerie optique intrinsèque. Imagerie profonde du néocortex est possible avec optimale chirurgies fenêtre crânienne. D'exploitation dans les conditions les plus stériles possibles pour éviter les infections, avec l'aide d'un soin extrême de ne pas endommager la dure-mère pendant la chirurgie, entraînera réussie et durable de verre recouverte de fenêtres crâniennes.
Protocol
- Anesthetize souris avec l'isoflurane (4% pour l'induction, de 1,5-2% pour la chirurgie) à l'aide du IACUC procédures approuvées. Il est important que la queue et / ou pincées orteils sont utilisées afin de s'assurer que l'animal est complètement sous sédation.
- L'utilisation d'un coupe-rongeurs, raser les poils du dos de la nuque jusqu'aux yeux.
- Placez la souris dans un cadre stéréotaxique, au cours d'une chirurgie de l'eau de recirculation couverture. De fixer solidement la tête avec des barres de l'oreille.
- Appliquer une pommade oculaire, afin d'empêcher l'œil de l'animal de se dessécher.
- Administrer, par voie sous cutanée, la dexaméthasone (0,2 mg / kg) et carprofène (5 mg / kg) pour éviter le gonflement du cerveau et / ou une réponse inflammatoire, respectivement.
- Avant de commencer la chirurgie, la stérilisation de la zone d'exploitation en essuyant la peau avec trois coups en alternance de l'alcool 70% et la bétadine.
- Tous les instruments chirurgicaux ont été pré-stérilisés à l'aide d'un stérilisateur à billes de verre. Avec des ciseaux qui ont été stérilisés avec de l'éthanol, enlever la peau sur le dessus du crâne, à commencer par une coupe horizontale tout le long de la base de la tête, suivie de deux coupes dans la direction rostrale, atteignant presque les paupières, puis deux coupes obliques qui convergent vers la ligne médiane.
- Une goutte de solution de lidocaïne + adrénaline est appliquée à ce point sur le périoste pour éviter un saignement excessif ou la douleur. Avec un scalpel, rétracter le périoste sur les bords du crâne. En outre, la légère rétraction des muscles de l'arrière du cou.
- Gratter délicatement toute la surface exposée du crâne avec le scalpel pour créer une surface sèche. Ceci est très important, car elle permettra à la colle de mieux adhérer lorsqu'il est appliqué plus tard.
- Une fois un site d'imagerie a été choisi, on est prêt à créer la fenêtre crânienne. D'abord, doucement "dessiner" un cercle d'environ 4 mm de diamètre avec la perceuse pneumatique dentaire.
- Après une légère forages, appliquer la solution de lidocaïne + adrénaline à nouveau sur la surface du crâne. Arrêter le forage lorsque une très fine couche d'os est à gauche. En poussant doucement sur le centre de la craniotomie à sentir combien il cède la place, on peut généralement savoir que ce stade est atteint.
- En vertu d'une goutte de sérum physiologique et en prenant avantage des travées osseuses - la structure spongieuse de l'os - déloger la craniotomie du crâne avec une pince pointe très fine. La solution saline est important, car il aidera à soulever le crâne et prévenir les saignements de la mère.
- Appliquer Gelfoam qui a été préalablement trempées dans une solution saline pour la dure-mère d'arrêter un saignement qui se produit occasionnellement de petits lorsque le crâne est enlevée.
- Après séchage de la surface de la dure-mère et en assurant qu'il n'ya pas de saignement, en douceur jeter stériles de 5 mm lamelle de verre sur le dessus de la dure-mère. (Remarque: d'autres groupes également placer une goutte de faible point de fusion d'agarose (1,2%) au cours de la durée et de mettre la lamelle sur le dessus de l'agar-agar).
- Appliquez une goutte de colle à base de cyanoacrylate-à l'hémisphère opposé sur le crâne. Avec l'aide d'une aiguille, appliquer doucement la colle tout autour de la fenêtre tout en faisant attention de ne pas la mettre sous verre. La colle peut maintenant être appliqué en couche mince sur toute la surface du crâne.
- Une fois la colle séchée, mélange acrylique dentaire et l'appliquer sur toute la surface du crâne, qui couvre également une jante petite partie de la lamelle, de le sécuriser.
- Après avoir sécurisé la lamelle, faites un petit puits autour de la fenêtre à l'acrylique dentaire. Aussi, intégrer une barre de titane à l'acrylique dentaire. Cette barre sera ensuite utilisé pour attacher la souris en toute sécurité sur la scène du microscope pour l'imagerie. Il est important de s'assurer que la barre est de niveau, de sorte qu'il est parallèle à la fenêtre crânienne. Placer un morceau de papier sous la barre peut permettre à la barre pour rester au niveau alors que les acryliques se durcit.
- L'acrylique dentaire est permis de guérir (durcir) pendant 10 minutes, moment où la barre de titane est fixé en place. Placez l'animal dans une cage au chaud jusqu'à ce qu'elle récupère.
- Après récupération de l'anesthésie, l'animal peut être imagée le même jour.
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Discussion
Comme nous l'avons montré dans la vidéo et dans les figures complémentaires, la préparation fenêtre crânienne, combinées avec l'utilisation de microscopie à deux photons, est un outil très puissant pour étudier in vivo la structure et la fonction du néocortex. La technique requiert une formation rigoureuse pour se familiariser avec l'anatomie pertinentes et les procédures chirurgicales fines et les compétences que requiert cette préparation. Seuls les chirurgies vierges peuvent être utilisés pour l'imagerie chronique. Si la mère est manipulé de manière excessive ou perforé, la préparation ne doit pas être utilisé pour l'imagerie.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl) | Drug | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| Dexamethasone | Drug | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet Powder | Reagent | LANG | To be mixed with the acrylic | |
| Jet-Acrylic Liquid | Reagent | LANG | To be mixed with Ortho-Jet Powder | |
| Round Glass Cover Slip | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 5 mm diameter |
| Gelfoam | Surgery | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Titanium bars are custom-made | ||||
References
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
