Summary
Это видео и протоколом продемонстрировать, как имплантат застекленным окном черепа у грызунов. Эти препараты могут быть использованы при хронических в естественных условиях двухфотонного изображения новой коры на временных масштабах месяцев. Он также может быть использован и для других типов изображений, в том числе оптических внутренней визуализации сигнала.
Abstract
Методов визуализации становятся все более важными в исследовании функции мозга. Среди них, двухфотонного микроскопии лазерного сканирования возникла как чрезвычайно полезный метод, поскольку он позволяет изучать живой нетронутой мозга. При соответствующей подготовки, эта техника позволяет наблюдать же области коры хронически, от нескольких минут до нескольких месяцев. В этом видео мы покажем, подготовка к хроническим в естественных изображений мозга с помощью двухфотонной микроскопии. Этот метод был впервые удалось доктор Карел Свобода, который в настоящее время Медицинского института Говарда Хьюза следователя на Janelia Farm. Подготовка, как показано здесь, может использоваться для работы с изображениями из неокортекса структуры (например, дендритные и аксонального динамика), для записи нейронной активности с использованием кальций-чувствительной краски, изображения корковой динамики кровотока, или для собственного оптические исследования изображений. Глубокая изображений неокортекса можно с оптимальным черепной хирургии окна. Действуя под наиболее стерильных условиях возможное, чтобы избежать инфекции, наряду с использованием особой осторожностью, чтобы не повредить мозговой оболочки во время операции, приведет к успешной и длительной застекленным черепных окон.
Protocol
- Обезболить мышей с изофлуран (4% для индукции, 1,5-2% для хирургии), используя IACUC утвержденными процедурами. Важно, чтобы хвост и / или ног пинчей используются для того, чтобы обеспечить животным полностью седации.
- Использование грызунов триммер, брить волосы от затылка до глаз.
- Наведите в стереотаксической раме, над водой хирургии рециркуляции одеяло. Твердо безопасный голову ухом баров.
- Применение глазной мази, для того, чтобы предотвратить глаз животного от высыхания.
- Администрирование, подкожно, дексаметазон (0,2 мг / кг) и Carprofen (5 мг / кг), чтобы предотвратить отек мозга и / или воспалительная реакция, соответственно.
- Перед началом операции, стерилизация операционной области, протирая кожу с тремя переменного пойло 70% спирта и бетадин.
- Все хирургические инструменты были предварительно стерилизованные использовании стерилизатор стеклянных бус. Использование ножницами, которые были стерилизованы с этанолом, удалить кожу над верхней части черепа, начиная с горизонтальный разрез по всей базе голове, а затем два сокращения ростральном направлении, почти достигая веками, то две косые разрезы , которые сходятся на средней линии.
- Капля лидокаин раствор адреналина + применяется в этот момент на надкостницы, чтобы избежать чрезмерного кровотечения или боль. С скальпель, отказаться надкостницы к краям черепа. Кроме того, слегка втяните мышцы задней поверхности шеи.
- Аккуратно очистить весь пораженном участке черепа с скальпеля создать сухую поверхность. Это очень важно, так как это позволит клея придерживаться лучше, когда применяется позже.
- После визуализации сайта был выбран один готов создать черепных окна. Во-первых, осторожно "рисовать" круг около 4 мм в диаметре, с пневматической бормашины.
- После небольшой бурения, применять лидокаин + эпинефрин раствор вновь на поверхности черепа. Стоп бурения, когда очень тонкий слой кости слева. При нажатии мягко центре трепанации черепа, чтобы почувствовать, как она дает способ, можно как правило, знают, что эта стадия будет достигнута.
- В капле физиологического раствора и воспользовавшись костных трабекул - губчатая структура кости - подъем от трепанации черепа из черепа с очень тонким пинцетом кончик. Солевой важно, так как это поможет поднять черепа и предотвращения кровотечения из оболочки.
- Применить Gelfoam, который был ранее пропитанную физиологическим раствором для твердой мозговой оболочки, чтобы остановить любое небольшое кровотечение, которое иногда имеет место, когда черепа удаляется.
- После высыхания поверхность твердой мозговой оболочки и обеспечение того, нет кровотечения, мягко лежали стерильные 5 мм стекло покровное стекло поверх твердой мозговой оболочки. (Примечание: другие группы также поместить каплю низкой температурой плавления агарозы (1,2%) над твердой мозговой оболочки и положить покровное на вершине агар).
- Применять капли cyanocrylate основе клея на противоположное полушарие на черепе. С помощью иглы, осторожно применять клей все вокруг окна, будучи осторожным, чтобы не ставят ее под стекло. Клей теперь могут быть применены в тонкий слой по всей поверхности черепа.
- После высыхания клея, смешать стоматологических акриловых и применять его по всей поверхности черепа, охватывающий также небольшим края покровным стеклом, чтобы обеспечить это.
- После обеспечения покровным стеклом, сделать небольшой колодец вокруг окна с зубной акрила. Кроме того, вставлять титан бар в стоматологических акриловых. Этот бар в дальнейшем будет использоваться для подключения мыши надежно на стадии микроскоп для работы с изображениями. Важно, чтобы гарантировать, что бар уровне, так, чтобы она параллельно с черепно окна. Размещение бумажку под бар может позволить бар, чтобы оставаться на уровне в то время как акриловые затвердевает.
- Стоматологических акриловых разрешено лечить (затвердевают) в течение 10 минут, к тому времени титана бара фиксируется на месте. Место животное в теплой клетке, пока не восстановится.
- После выздоровления от наркоза, животное может быть отображены в тот же день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как было показано в видео и в дополнительных фигур, черепно подготовке окно, в сочетании с использованием двух-фотонной микроскопии, является очень мощным инструментом для изучения в естественных условиях структуры и функции коры головного мозга. Техника требует упорных тренировок, чтобы ознакомиться с соответствующими анатомии и тонкой хирургической процедуры и навыки, что этот препарат требует. Только нетронутой операции могут быть использованы для хронических изображений. Если длительность манипулируют чрезмерно или проткнуть, препарат не должен использоваться для визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl) | Drug | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| Dexamethasone | Drug | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet Powder | Reagent | LANG | To be mixed with the acrylic | |
| Jet-Acrylic Liquid | Reagent | LANG | To be mixed with Ortho-Jet Powder | |
| Round Glass Cover Slip | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 5 mm diameter |
| Gelfoam | Surgery | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Titanium bars are custom-made | ||||
References
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
