Summary
בסרטון הזה, אנו מראים נוהל משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך הרקמה לחיות עם אקדח גנים רומן זעיר. אנחנו מפילה את הביטוי של מולקולות הנחיה Netrin האקסון בעוברים עלוקה על ידי אספקת מולקולות של dsRNA בקיר גוף הגחון ועל הגרעינים של מגזרים בודדים.
Abstract
בסרטון הזה, אנו מראים את השימוש באקדח פנאומטי נימי עבור משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך רקמת חיים. אנו משתמשים בהליך לביטוי דפוסי להפריע גנים מגזרים נבחרים של עוברים עלוקה, עוזב את פלחי מטופל כמו בקרות פנימיות.
אקדח פנאומטי נימי ניתן להשתמש כדי להגיע לשכבות הפנימיות של תאים בשלבים המוקדמים של הפיתוח מבלי לפתוח את הדגימה. כשיטה מבוא מקומי של חומרים אל תוך רקמות חיות, המסירה biolistic עם האקדח יש מספר יתרונות: הוא מהיר, ללא מגע ולא הרסנית. בנוסף, אקדח נימי יחיד יכול לשמש לאספקת עצמאית של חומרים שונים. אזור המשלוח יכול להיות ממדים לרוחב של ~ 50-150 מיקרומטר והוא משתרע על פני כ ~ 15 מיקרומטר עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. מסירה זו יש את היתרון של היכולת היעד מספר מוגבל של תאים במיקום שנבחר ביניים בין תא בודד להפיל על ידי microinjection ו מציאה מערכתי באמצעות זריקות או תאיים באמצעות גישות גנטיות.
עבור דריסה או לדפוק בביטוי של Netrin מולקולה הדרכה האקסון, אשר באה לידי ביטוי באופן טבעי על ידי כמה נוירונים המרכזי בקיר גוף הגחון, אך לא את תחום הגבי, אנו מספקים מולקולות של dsRNA או DNA פלסמיד, לתוך הקיר הגוף מרכזי הגרעינים. הליך זה כולל את השלבים הבאים: (א) הכנת תוכנית ההתקנה ניסיוני assay מסוים (התאמת הלחץ מאיץ), (ii) ציפוי חלקיקים עם מולקולות של dsRNA או DNA, (iii) טעינת חלקיקים מצופים לתוך האקדח, עד שני ריאגנטים באחד assay, (ד) הכנת חיות למסירה החלקיקים, (v) משלוח של חלקיקים מצופים לרקמת המטרה (קיר הגוף או הגנגליונים), ו (vi) עיבוד עוברי (immunostaining אימונוהיסטוכימיה ו העצבית תיוג) כדי לחזות את התוצאות, בדרך כלל 2 עד 3 ימים לאחר הלידה.
כאשר החלקיקים היו מצופים netrin dsRNA, הם גרמו בבירור לדפוק למטה הביטוי netrin שרק התרחש התאים המכילים חלקיקים (בדרך כלל, 1-2 חלקיקים בכל תא). חלקיקים מצופים פלואורסצנטי קידוד פלסמיד EGFP המושרה בתאים עצביים כאשר הם עצרו הגרעינים שלהם.
Protocol
חלקיקים יכולים להיות מצופים חומרים כימיים שונים, כגון מולקולות dsRNA, פלסמידים DNA או צבעים. סוג וקוטרו של חלקיקים נבחרים על פי מגיב ועומק התאים היעד ברקמות: חלקיקים גדולים יותר לחדור, אך עלול לגרום נזק לרקמה.
1. הכנה של חלקיקים dsRNA מצופה
- מקום 100% isopropanol על הקרח.
- Resuspend 5 מ"ג חלקיקי זהב (S1600ri, Seashell טכנולוגיה, LLC, הקוטר הממוצע 1.6 מיקרומטר) במאגר מחייב 100 מ"ל. כאשר פתרון מוכן להמשיך לשלב הבא.
- לדלל את הפתרון החלקיקים על ידי הוספת 100 μl של חיץ מחייב, בקיצור מערבולת sonicate דקות 1-2 להימנע clumping.
- הוסף 5-10μg של dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA צריכים להיות מומס במים ריכוז של ~ 1μg/μl).
- וורטקס ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. אלה התוצאה ריכוז מרווח זמן של siRNA רווי חלקיקי זהב.
- גלולה siRNA / זהב מתחמי החלקיקים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2500 ~ בצנטריפוגה ספסל הדף עבור ~ 15 שניות.
- הסר את supernatant בעדינות להוסיף 750 מ"ל קר isopropanol עם הפרעה מזערית של גלולה. ספין בקצרה ולהסיר את supernatant.
- Resuspend חלקיקי זהב 100 μl isopropanol 100% קר, אז sonicate בקצרה sonicator אמבטיה (2-3 פולסים) כדי לשבור את agglomerates החלקיקים. אחרונה, ושופכים את החלקיקים המרחפים על גבי זכוכית נושאת ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
2. הכנת התקנה ניסיונית assay מסוים
- לכל אחד יש אקדח בקוטר שונה הצמצם זרבובית, החל מינימום של ~ ~ 50μm עד 3 מ"מ. ספציפית לשמש האקדח נבחר ולכן על פי אזור של רקמה להיות ממוקד.
- הלחץ הוא מותאם לעומק ברקמה של תאים היעד, בדרך כלל עד ~ 100μm (בלחצים גבוהים יותר יכולים לספק את חלקיקי עמוק יותר). המרחק בין העובר לבין קצה הנחיר משפיע גם על עומק החדירה, כמו המומנטום זהב רופפים באוויר.
3. טוען את האקדח עם טרום מצופה חלקיקי
חלקיקים יש לטעון כאבקה יבשה לתוך צינורות tygon החלקיקים קווי זריקה מחוברת סעפת. זה צינורות, אשר צריך להישמר באווירה יבש 4 ° C כאשר לא בשימוש, ניתן שימוש חוזר בניסויים נוספים עם ריאגנטים אותו. התקנה ניסיונית שלנו יכול לספק עד שני חומרים כימיים שונים לכל assay דרך יציאות נפרדות סעפת.
- גרדו את חלקיקי מצופה יבשים מן הכוס שקופיות באמצעות קצה של פיסת זכוכית לכסות או סכין גילוח לפני טעינת אותם לתוך קו צינורות tygon. זה צינורות tygon יהיה ספציפי רק מגיב זה כדי למנוע זיהום לחצות.
- כפי שאתה טוען את החלקיקים, לכופף את הצינור לצורה U קרוב למחבר, כדי לשמור על חלקיקים מלהתפשט לאורך צינורות כולו מרוכז קרוב למחבר. תרימי את חלקיקי עם מרית קטנה או פיסת נייר מקופלת לשקול, עומס כמחציתם לתוך צינורות עבור כל סדרה של עוברים. הקש על צינורות במהלך שלב הטעינה כדי להפיץ את חלקיקי שווה.
4. הכנת בעלי חיים
לפני ואחרי הלידה חלקיק הזהב, העוברים נשמרים מים סטריליים בריכה מלאכותית בטמפרטורת החדר.
- מניחים את העוברים, בצד הגחוני מעלה, בחריץ חצוב לתוך חתיכת שטוח 5 מ"מ בעובי, של גומי סיליקון (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) ו לטשטש אותן בתמיסה של אתנול 8% מים סטריליים בריכה מלאכותית ( הצעירים עוברים בשלבים E6-E8 יכול להישאר במים בריכה מלאכותית עם אתנול לא לאורך הניסוי).
- מיד לפני הירי חלקיקים, להוריד את רמת אמבטיה לחשוף את פני השטח הגחון של העוברים על ידי הסרת חלק מהפתרון. מניחים פיסת נייר עם חור קטן לחתוך באמצע על גבי זה כדי לייצב אותה כדי לשמור על השטח שלו מפני התייבשות.
5. מסירה של חלקיקים מצופים לרקמת המטרה
אחת עומס של חלקיקים יכול בדרך כלל לשמש עד עשר יריות, עם ירייה בודדת בדרך כלל אספקת בסדר גודל של מאה חלקיקים בודדים.
- צור זריקה ידי פתיחת אחד השסתומים של 0.3 s, גורמת הזרקה של בולוס של חלקיקים מקו צינור המקביל לתוך האקדח.
- הקש על צינורות בעדינות בין היריות כדי לסלק חלקיקים מן הקיר צינורות ובכך להקל על זריקה שלהם לתוך זרם הוא האקדח.
- כדי לכסות את אזור של רקמה של עניין, מספר יריות ייתכן שתידרש.
- לאחר הלידה החלקיקים, במקום עוברים בחזרה לתוך המים באגם מלאכותי, עדיף מישהו עובר היטב לכל צלחת רב באר.
6. חיסוניתמכתים וסימון העצבית
שמור את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך 1 עד 3 ימים לאחר הלידה החלקיקים, עד RNAi (או ביטוי אקטופי) מושגת. לאחר מכן, אנו לבצע אחד מההליכים הבאים על דגימות בקרות ניסיוניים:
- ב הכלאה באתרו כדי assay עבור נוכחות או היעדר של mRNA Netrin. Digoxigenin שכותרתו עלוקה riboprobes netrin הם עוברים הכלאה אל עלוקה כולו.
- Immunocytochemistry כדי assay לחלבון Netrin וחלבונים אחרים אשר הינם ייחודיים לרקמה העצבית (כגון טובולין acetylated אנטי). ההליך מבוצע גם על כל הר עוברים.
- Microinjections של צבעים lipophilic (DiI ו Dio) לתוך נוירונים בודדים, עבור צבען ממלא לתווית סוכות מלא של נוירונים עניין (נוירונים לחץ mechanosensory במקרה שלנו) במגזרי השליטה מטופלים. Assay זה מבוצע על עוברים לחיות (שלמים או גזור).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהפגנה זו, השתמשנו אקדח פנאומטי נימי להעביר חלקיקי זהב לתוך תאים בנפח מקומי קטן של העובר עלוקה לחיות לדפוק-in לדפוק למטה גנים. אזור היעד היה בדרך כלל בקוטר של ~ 150 מיקרומטר וחלקיקים נמצאו ~ 15 מיקרומטר סביב עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. כאשר החלקיקים היו מצופים מולקולות dsRNA של netrin גורם הדרכה האקסון, הם גרמו בבירור לדפוק למטה הביטוי netrin שרק התרחש התאים המכילים חלקיקים. חלקיקים מצופים פלואורסצנטי קידוד פלסמיד GFP המושרה בתאים עצביים כאשר הם עצרו הגרעינים שלהם.
הראינו לך איך את האקדח פנאומטי נימי נותן את טכניקת המסירה biolistic יכולת חדשה, כדי למקד את אזורים מיקרוסקופיים של רקמות מוקף בשלושה ממדים ממוקד עם דיוק גבוהה, ללא נזק לרקמות לזיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר מיכאל בייקר על עזרתו ביצירת מבנים עבור גן עקום פנימה לצורך מתן זמן לשגות סרטים התחזיות החושית הגוברת. אנחנו רוצים גם להודות וירג'יניה Vandelinder לקבלת סיוע טכני עם הניסויים אקדח פנאומטי.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
