Summary
इस वीडियो में, हम जीवित ऊतक में एक सटीक biolistic अभिकर्मकों के एक उपन्यास लघु जीन बंदूक के साथ वितरण के लिए एक प्रक्रिया दिखा. हम नीचे दस्तक दे रहे हैं उदर शरीर दीवार और एकल क्षेत्रों के ganglia में dsRNA के अणुओं देने से जोंक भ्रूण में अक्षतंतु मार्गदर्शन अणु Netrin की अभिव्यक्ति.
Protocol
कण dsRNA अणु, डीएनए plasmids या रंजक के रूप में अलग अभिकर्मकों, के साथ लेपित किया जा सकता है है. प्रकार और कणों के व्यास अभिकर्मक और ऊतकों में लक्षित कोशिकाओं की गहराई के अनुसार चुना जाता है: बड़े कणों आगे घुसना, लेकिन कुछ ऊतकों को नुकसान का कारण हो सकता है.
1. DsRNA लेपित कण तैयार
- 100 isopropanol% बर्फ पर रखें.
- 100 मिलीलीटर बाध्यकारी बफर में, Resuspend 5 मिलीग्राम सोने के कणों (औसत व्यास 1.6 सुक्ष्ममापी S1600ri, शंख प्रौद्योगिकी, LLC). जब समाधान के लिए तैयार है, तो अगले कदम के लिए जारी है.
- बाध्यकारी बफर, भंवर संक्षिप्त और 1-2 मिनट के लिए sonicate clumping से बचने के 100 μl जोड़कर कण समाधान पतला.
- DsRNA / siRNA के 5 10μg जोड़ें (dsRNAs / siRNA पानी में ~ 1μg/μl की एकाग्रता को भंग किया जाना चाहिए).
- भंवर और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़. SiRNA में इन एकाग्रता और समय अंतराल परिणाम सोने के कणों संतृप्त.
- गोली siRNA / सोने ~ ~ 15 सेकंड के लिए एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में 2500 आरपीएम पर centrifugation द्वारा कण परिसरों.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे गोली के न्यूनतम विघटन के साथ 750 मिलीलीटर ठंड isopropanol जोड़ने. संक्षेप में स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- 100 μl ठंड 100% isopropanol में सोने के कणों Resuspend, तो एक स्नान sonicator में संक्षेप में sonicate (2-3 दालों) कण agglomerates को तोड़ने. पिछले है, एक गिलास स्लाइड पर निलंबित कणों डालना और कमरे के तापमान पर सूखे की अनुमति.
2. एक विशिष्ट परख के लिए प्रयोगात्मक सेटअप की तैयारी
- प्रत्येक बंदूक एक अलग नोक एपर्चर व्यास है ~ 3mm ~ 50μm की एक न्यूनतम से लेकर. बंदूक के लिए इस्तेमाल किया जा विशिष्ट इसलिए ऊतक के क्षेत्र को लक्षित किया जा के अनुसार चुना है.
- दबाव उन्होंने लक्ष्य कोशिकाओं के ऊतकों में गहराई के लिए निकाला जाता है, आम तौर पर ~ 100μm (उच्च दबाव कणों गहरी वितरित कर सकते हैं). भ्रूण और नोजल की नोक के बीच की दूरी भी हवा में सोने के कणों ढीली गति के रूप में प्रवेश गहराई को प्रभावित करता है.
3. पूर्व लेपित कणों के साथ बंदूक लोड हो रहा है
कण tygon टयूबिंग कण इंजेक्शन कई गुना करने के लिए जुड़े लाइनों में एक सूखे पाउडर के रूप में लोड किया जाना चाहिए. इस टयूबिंग, जो 4 में एक शुष्क वातावरण में रखा जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस जब उपयोग में नहीं किया जा सकता है फिर वही अभिकर्मकों के साथ अतिरिक्त प्रयोगों में इस्तेमाल किया. हमारा प्रयोगात्मक सेटअप कई गुना में अलग बंदरगाहों के माध्यम से परख प्रति दो अलग अभिकर्मकों के लिए वितरित कर सकते हैं.
- कांच से सूखे लेपित कणों परिमार्जन उन्हें tygon टयूबिंग लाइन में लोड करने से पहले एक गिलास को कवर पर्ची या एक धार की धार का प्रयोग स्लाइड है. यह tygon टयूबिंग केवल इस अभिकर्मक विशिष्ट पार संक्रमण से बचने जाएगा.
- जैसा कि आप कणों लोड, एक यू संबंधक करने के लिए करीब आकार में टयूबिंग मोड़, पूरे टयूबिंग और करीब संबंधक करने के लिए ध्यान केंद्रित के साथ फैलने से कणों रखने. एक छोटा सा रंग या मुड़ा हुआ कागज वजन का एक टुकड़ा के साथ कणों को उठाओ, और भ्रूण की प्रत्येक श्रृंखला के लिए टयूबिंग में उनमें से लगभग आधे लोड. लोड हो रहा है कणों को समान रूप से फैला चरण के दौरान टयूबिंग ठोकर.
4. पशु तैयारी
पहले और बाद में सोने के कण वितरण, भ्रूण बाँझ कृत्रिम तालाब के पानी में कमरे के तापमान पर रखा जाता है.
- भ्रूण, उदर पक्ष प्लेस, एक सिलिकॉन रबर (184 Sylgard, डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) के एक फ्लैट, 5mm मोटी टुकड़ा में नक्काशीदार नाली में और उन्हें बाँझ कृत्रिम तालाब के पानी में 8% इथेनॉल की एक समाधान में चतनाशून्य करना ( E6 E8 चरणों में युवा भ्रूण कोई इथेनॉल के साथ कृत्रिम तालाब के पानी में प्रयोग भर ही कर सकते हैं).
- तुरंत कणों की शूटिंग से पहले, स्नान के स्तर को कम करने के लिए समाधान का हिस्सा हटाने के द्वारा भ्रूण के ventral सतह को उजागर. एक छोटे से छेद के साथ यह की चोटी पर बीच में कटौती करने के लिए इसे स्थिर और सूखने से इसकी सतह रखने टिशू पेपर का एक टुकड़ा रखें.
5. लेपित कणों के लक्ष्य के ऊतकों में डिलिवरी
कणों के एक लोड आमतौर पर दस शॉट्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक शॉट आमतौर पर कुछ सौ कणों के आदेश पर पहुंचाने के साथ हो.
- 0.3 एस के लिए वाल्व खोलने बंदूक में इसी टयूबिंग लाइन से कणों का एक सांस के इंजेक्शन के कारण एक शॉट उत्पन्न करता है.
- टयूबिंग धीरे शॉट्स के बीच में टयूबिंग दीवार से कणों को बेदखल करने और इस प्रकार वह बंदूक की धारा में उनके इंजेक्शन की सुविधा ठोकर.
- ब्याज के ऊतकों के क्षेत्र को कवर करने के लिए, कई शॉट की आवश्यकता हो सकती है.
- कण प्रसव के बाद, भ्रूण बहु अच्छी तरह से एक थाली में वापस कृत्रिम तालाब के पानी, अच्छी तरह से प्रति अधिमानतः एक भ्रूण में जगह.
6. इम्यूनोधुंधला हो जाना और neuronal लेबलिंग
कमरे के तापमान पर और अंधेरे में भ्रूण कण प्रसव के बाद 1 से 3 दिनों के लिए रखें जब तक आरएनएआई (या अस्थानिक अभिव्यक्ति) हासिल की है. हम तो एक प्रयोगात्मक नमूनों और नियंत्रण पर निम्नलिखित प्रक्रियाओं के ले:
- Netrin mRNA की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए परख के लिए स्वस्थानी संकरण में . Digoxigenin लेबल जोंक netrin riboprobes पूरे जोंक भ्रूण के लिए संकरित हैं.
- Netrin प्रोटीन और अन्य प्रोटीन जो neuronal ऊतक (जैसे विरोधी acetylated ट्यूबिलिन) के लिए अद्वितीय हैं के लिए परख के लिए Immunocytochemistry . प्रक्रिया भी पूरी माउंट भ्रूण पर किया जाता है.
- एकल न्यूरॉन्स में lipophilic (DiI और Dio) के लिए ब्याज की (हमारे मामले में mechanosensory दबाव न्यूरॉन्स) के इलाज और नियंत्रण के क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की पूरी arbors लेबल डाई भरता, रंग की Microinjections. इस परख रहते भ्रूण (अक्षुण्ण या dissected) पर किया जाता है.
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Discussion
इस प्रदर्शन में, हम साँस का केशिका बंदूक का इस्तेमाल किया कोशिकाओं में एक जीवित जोंक भ्रूण के छोटे स्थानीयकृत मात्रा में सोने के कणों दस्तक देने और जीन नीचे दस्तक. आम तौर पर लक्ष्य क्षेत्र की एक व्यास था ~ 150 सुक्ष्ममापी और कणों पाया गया ~ मतलब प्रवेश गहराई लगभग 15 सुक्ष्ममापी, जो 0 और 50 सुक्ष्ममापी के बीच समायोज्य था. जब कणों अक्षतंतु मार्गदर्शन कारक netrin के dsRNA अणुओं के साथ लेपित रहे थे, वे स्पष्ट रूप से के कारण होता है दिखाई netrin अभिव्यक्ति है कि केवल कणों से युक्त कोशिकाओं में हुई दस्तक नीचे है. कण एक प्लाज्मिड neuronal कोशिकाओं में एन्कोडिंग GFP प्रेरित प्रतिदीप्ति जब वे उनके नाभिक में बंद कर दिया के साथ लेपित.
हम तुम से पता चला है कैसे न्युमेटिक बंदूक केशिका biolistic डिलीवरी की तकनीक एक नई क्षमता देता है, तीन आयामों में ही सीमित है और उच्च परिशुद्धता के साथ लक्षित ऊतक के सूक्ष्म क्षेत्रों को लक्षित ऊतकों को detectable क्षति के बिना.
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Acknowledgments
हम तोड़े और बढ़ रही संवेदी अनुमानों के समय चूक फिल्मों प्रदान करने के लिए जीन के लिए constructs पैदा करने में उनकी मदद के लिए डॉ. माइकल बेकर को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी न्युमेटिक बंदूक प्रयोगों के साथ तकनीकी सहायता के लिए वर्जीनिया Vandelinder धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
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