Summary
In questo video vi mostriamo una procedura per una consegna precisa biolistic dei reagenti nel tessuto vivo con una pistola romanzo gene in miniatura. Stiamo abbattendo l'espressione della molecola netrina guida degli assoni negli embrioni sanguisuga fornendo molecole di dsRNA nella parete ventrale del corpo e dei gangli di singoli segmenti.
Abstract
In questo video, che mostrano l'uso di una pistola pneumatica capillare per la consegna accurata biolistic dei reagenti nel tessuto vivo. Usiamo la procedura per i modelli di espressione genica turbare in segmenti selezionati di embrioni sanguisuga, lasciando i segmenti non trattati come controlli interni.
La pistola pneumatica capillare può essere utilizzato per raggiungere gli strati interni di cellule nelle fasi precoci dello sviluppo senza aprire il campione. Come metodo per l'introduzione di sostanze localizzato nei tessuti viventi, la consegna biolistic con la pistola ha diversi vantaggi: è veloce, senza contatto e non distruttiva. Inoltre, una pistola singolo capillare può essere utilizzato per la consegna indipendente di sostanze diverse. La regione di consegna può avere dimensioni laterali di circa 50-150 micron e si estende su circa 15 micron intorno alla profondità di penetrazione media, che è regolabile tra 0 e 50 micron. Questa consegna è il vantaggio di essere in grado di indirizzare un numero limitato di celle in una posizione intermedia tra selezionato singola cella abbattere da microiniezione e knockdown sistemico attraverso iniezioni extracellulare o mediante approcci genetici.
Per abbattere o bussare nell'espressione del netrina molecola guida degli assoni, che è naturalmente espresso da alcuni neuroni centrali e nella parete ventrale del corpo, ma non il dominio dorsale, forniamo le molecole di dsRNA o plasmide-DNA nella parete del corpo e gangli centrali. Questa procedura prevede le seguenti fasi: (i) la preparazione del setup sperimentale per un test specifico (la regolazione della pressione di accelerazione), (ii) il rivestimento di particelle con le molecole di dsRNA o DNA, (iii) le particelle di carico rivestito nella pistola, fino a due reagenti in un saggio, (iv) preparare gli animali per la consegna delle particelle, (v) la consegna di particelle rivestite in tessuto bersaglio (parete del corpo o gangli), e (vi) il trattamento degli embrioni (immunostaining, immunoistochimica e neuronali etichettatura) per visualizzare i risultati, di solito 2 o 3 giorni dopo il parto.
Quando le particelle sono stati rivestiti con netrina dsRNA, hanno causato ben visibili knock-down di espressione netrina che si è verificato solo nelle cellule contenenti particelle (in genere, 1-2 particelle per cella). Particelle rivestite con un plasmide fluorescenza EGFP codifica indotta in cellule neuronali quando si fermarono nel loro nucleo.
Protocol
Particelle possono essere rivestiti con diversi reagenti, come le molecole dsRNA, plasmidi DNA o coloranti. Il tipo e il diametro delle particelle sono scelti in base al reagente e la profondità delle cellule bersaglio nei tessuti: le particelle più grandi penetrare ulteriormente, ma può causare qualche danno al tessuto.
1. Preparazione di particelle rivestito dsRNA
- Posto al 100% isopropanolo sul ghiaccio.
- Risospendere 5 mg di particelle d'oro (S1600ri, Seashell Technology, LLC; diametro medio di 1,6 micron) in 100 ml di tampone vincolanti. Quando la soluzione è pronta, passare alla fase successiva.
- Diluire la soluzione di particelle aggiungendo 100 ml di buffer di legame, mescolare brevemente nel vortex e sonicare per 1-2 minuti per evitare grumi.
- Aggiungi 5-10μg di dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA deve essere sciolto in acqua ad una concentrazione di circa 1μg/μl).
- Vortex e lasciare a temperatura ambiente per 2 minuti. Questi risultati intervallo di concentrazione e dal tempo in siRNA satura di particelle d'oro.
- Pellet il siRNA / oro complessi delle particelle mediante centrifugazione a ~ 2.500 giri in una centrifuga da banco per ~ 15 sec.
- Rimuovere il surnatante e delicatamente aggiungere 750 ml di isopropanolo freddo con un'interruzione minima del pellet. Spin brevemente e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le particelle d'oro in 100 l freddo isopropanolo al 100%, poi sonicare brevemente in un bagno sonicatore (2-3 impulsi) per rompere agglomerati di particelle. Ultimo, versare le particelle in sospensione su un vetrino e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
2. Preparare il setup sperimentale per un test specifico
- Ogni arma ha un diverso diametro di apertura degli ugelli, che vanno da un minimo di 50 micron fino a ~ ~ 3 mm. Le specifiche da utilizzare per la pistola è quindi scelto a seconda della zona di tessuto su cui agire.
- Lui la pressione viene regolata per la profondità nel tessuto delle cellule bersaglio, in genere fino a ~ 100μm (alte pressioni in grado di fornire le particelle più profonda). La distanza tra l'embrione e la punta dell'ugello influisce anche sulla profondità di penetrazione, come momento d'oro particelle libere in aria.
3. Caricamento della pistola con la pre-particelle rivestite
Le particelle devono essere caricate come una polvere secca nelle linee di particelle tubi Tygon iniezione collegati al collettore. Questo tubo, che deve essere conservato in un ambiente asciutto a 4 ° C, quando non in uso, possono essere riutilizzati in ulteriori esperimenti con gli stessi reagenti. Il nostro apparato sperimentale in grado di fornire fino a due diversi reagenti per analisi attraverso porte separate nel collettore.
- Raschiare le particelle essiccate ricoperto dal vetro diapositive utilizzando il bordo di un vetrino di vetro o una lametta prima di caricarli nella linea di tubi Tygon. Questo tubo Tygon saranno specifiche solo per questo reagente per evitare contaminazioni incrociate.
- Come si caricano le particelle, piegare il tubo a forma di U vicino al connettore, per mantenere le particelle di diffondersi lungo il tubo intero e concentrati vicino al connettore. Raccogliere le particelle con una piccola spatola o un pezzo di carta piegato pesano, e caricare circa la metà di loro nel tubo per ogni serie di embrioni. Toccare il tubo durante la fase di carico di diffondere le particelle in modo uniforme.
4. Preparazione degli animali
Prima e dopo la consegna delle particelle d'oro, gli embrioni vengono conservati in acqua sterile laghetto artificiale a temperatura ambiente.
- Mettere gli embrioni, lato ventrale in su, in un solco scavato in un appartamento, 5mm di spessore pezzo di gomma siliconica (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) e anestetizzare in una soluzione di 8% di etanolo in acqua sterile laghetto artificiale ( più giovani embrioni in fasi E6-E8 può rimanere in acqua laghetto artificiale senza etanolo tutto l'esperimento).
- Immediatamente prima di sparare le particelle, abbassare il livello bagno per scoprire la superficie ventrale degli embrioni, eliminando una parte della soluzione. Posizionare un pezzo di carta velina con un piccolo foro tagliati a metà su di esso per stabilizzare e mantenere la sua superficie si secchi.
5. Consegna di particelle rivestite in tessuto bersaglio
Un carico di particelle in genere può essere utilizzato per un massimo di dieci scatti, con un solo colpo di solito consegna dell'ordine di poche centinaia di particelle.
- Genera un colpo aprendo una delle valvole di 0,3 s, causando l'iniezione di un bolo di particelle dalla linea di tubazione corrispondente nella pistola.
- Toccare il tubo dolcemente tra gli scatti per rimuovere le particelle dal muro tubi e quindi facilitare la loro iniezione nel flusso di lui la pistola.
- Per coprire l'area di tessuto di interesse, scatti multipli possono essere richiesti.
- Dopo la consegna delle particelle, posto che gli embrioni di nuovo in acqua laghetto artificiale, preferibilmente un embrione per bene in un multi-pozzetti.
6. Immunocolorazione e l'etichettatura dei neuroni
Mantenere gli embrioni a temperatura ambiente e al buio per 1 a 3 giorni dopo la consegna delle particelle, fino RNAi (o espressione ectopica) si ottiene. Abbiamo poi eseguire una delle seguenti procedure sui campioni sperimentali e controlli:
- Ibridazione in situ di test per la presenza o l'assenza di mRNA netrina. Digossigenina marcato sanguisuga riboprobes netrina sono ibridate agli embrioni sanguisuga intero.
- Immunocitochimica al test per le proteine netrina e di altre proteine che sono unici al tessuto neuronale (come anti tubulina acetilata). La procedura viene eseguita anche su tutto il montaggio degli embrioni.
- Microiniezioni di coloranti lipofili (DII e Dio) in singoli neuroni, per la tintura riempie di etichettare i pergolati completa dei neuroni di interesse (neuroni pressione mechanosensory nel nostro caso) in segmenti trattate ei controlli. Questo test viene eseguito su embrioni vivi (intatti o sezionato).
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Discussion
In questa dimostrazione, abbiamo usato la pistola pneumatica capillare per fornire particelle d'oro all'interno delle cellule localizzate in piccoli volumi di un embrione vivo sanguisuga per knock-in e knock-down geni. La regione del bersaglio in genere aveva un diametro di circa 150 micron e le particelle sono stati trovati circa 15 micron intorno alla profondità di penetrazione media, che è stato regolabile tra 0 e 50 micron. Quando le particelle sono stati rivestiti con molecole di dsRNA del netrina fattore guida degli assoni, hanno causato ben visibili knock-down di espressione netrina che si è verificato solo nelle cellule che contengono particelle. Particelle rivestite con un plasmide fluorescenza GFP codifica indotta in cellule neuronali quando si fermarono nel loro nucleo.
Vi abbiamo mostrato come la pistola pneumatica capillare dà la tecnica della consegna biolistic una nuova funzionalità, per indirizzare le regioni microscopiche di tessuto confinato in tre dimensioni e mirati con alta precisione, senza danni rilevabili al tessuto.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Michael Baker per il suo aiuto nella generazione di costrutti per gene knock-in e per la prestazione del time-lapse film di crescere proiezioni sensoriali. Vorremmo anche ringraziare Virginia Vandelinder di assistenza tecnica con gli esperimenti della pistola pneumatica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
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