Summary
В этом видео мы покажем процедуру точной biolistic доставки реагентов в живые ткани романа миниатюрный пистолет гена. Мы сбить выражение молекулы Netrin руководством аксонов в пиявка эмбрионов путем предоставления молекулы дсРНК в вентральной стенкой тела и ганглиях одного сегмента.
Abstract
В этом видео мы покажем, использование пневматических капиллярных пистолет для точного biolistic доставки реагентов в живые ткани. Мы используем процедуру возмущают шаблоны экспрессии генов в отдельных сегментах пиявки эмбрионов, оставив необработанными сегментов внутреннего контроля.
Пневматический пистолет капиллярной могут быть использованы для достижения внутренних слоев клеток на ранних стадиях развития, не открывая образца. В качестве метода локализованных введения веществ в живых тканях, biolistic поставки с пушкой имеет ряд преимуществ: он быстрый, бесконтактный и неразрушающий. Кроме того, одной капиллярной оружие может быть использовано для самостоятельной доставки различных веществ. Доставка регионе может иметь поперечные размеры ~ 50-150 мкм и распространяется на ~ 15 мкм вокруг средняя глубина проникновения, которая регулируется в пределах от 0 до 50 мкм. Эта поставка имеет преимущество в том, способна привлечь внимание ограниченное количество ячеек в выбранном месте промежуточное между одной клетки сбить путем микроинъекции и системных нокдаун через внеклеточную инъекции или с помощью генетических методов.
Для сбивания или стучать в экспрессии молекулы аксон руководством Netrin, которая, естественно, выраженные некоторыми центральными нейронами и в брюшной стенке тела, но не спинной области, мы поставляем молекулы дсРНК или плазмид-ДНК в стенке тела и центральных ганглиев. Эта процедура включает в себя следующие этапы: (я) подготовки экспериментальной установки для конкретного анализа (регулировка ускорения давления), (II) покрытия частиц с молекулами дсРНК или ДНК, (III) погрузка покрытых частиц в пушку, до двух реагентов в одном анализе, (IV) подготовке животных для доставки частиц, (V) доставка покрытых частиц в ткани-мишени (стенки тела или ганглии) и (VI) обработки эмбрионов (иммунной, иммуногистохимии и нейронных маркировки) для визуализации результатов, как правило, от 2 до 3 дней после поставки.
Когда частицы были покрыты netrin дсРНК, они вызвали отчетливо видны нокдауна от netrin выражение, которое произошло только в клетках, содержащих частицы (как правило, 1-2 частиц на клетку). Частицы покрытые плазмиды, кодирующей EGFP индуцированной флуоресценции в нервных клетках, когда они остановились в их ядер.
Protocol
Частицы могут быть покрыты различными реагентами, например, молекулы дсРНК, ДНК плазмиды или красители. Тип и диаметр частиц выбираются в зависимости от реагентов и глубину клетки-мишени в ткани: крупные частицы проникают дальше, но может вызвать некоторые повреждения тканей.
1. Подготовка дсРНК частицы, покрытые
- Разместить 100% изопропанола на льду.
- Ресуспендируют 5 мг частицы золота (S1600ri, Seashell технологии, ООО; средним диаметром 1,6 мкм) в 100 мл буфера для связывания. Когда раствор будет готов, переходите к следующему шагу.
- Развести частиц решение путем добавления 100 мкл буфера для связывания, вихревые кратко и разрушать ультразвуком в течение 1-2 минут, чтобы избежать слипания.
- Добавить 5-10 мкг дсРНК / миРНК (dsRNAs / миРНК следует растворить в воде до концентрации ~ 1μg/μl).
- Вихревой и оставить при комнатной температуре в течение 2 мин. Эти результате концентрации и временной интервал в миРНК насыщенный частицами золота.
- Гранул миРНК / золото частиц комплексов путем центрифугирования при 2500 оборотов в минуту ~ в настольной центрифуге в течение ~ 15 сек.
- Удалить супернатант и осторожно добавить 750 мл холодного изопропанола с минимальными помехами для гранул. Спиновые кратко и удалите супернатант.
- Ресуспендируют частицы золота в 100 мкл холодного 100% изопропанола, а затем разрушать ультразвуком кратко в ванной sonicator (2-3 импульсов) для разгона частиц агломератов. Последнее, залить взвешенных частиц на предметное стекло и дать высохнуть при комнатной температуре.
2. Подготовка экспериментальной установки для конкретного анализа
- Каждое оружие имеет разный диаметр диафрагмы сопла, в пределах от минимума ~ 50 мкм до ~ 3 мм. Конкретные, которые будут использоваться для оружия, следовательно, выбирается в зависимости от участка ткани должны быть целенаправленными.
- Он давление с поправкой на глубину в ткани клеток-мишеней, как правило, до ~ 100 мкм (более высокое давление может доставить частиц глубже). Расстояние между эмбрионом и кончик сопла также влияет на глубину проникновения, так как свободные частицы золота импульса в воздухе.
3. Загрузка пистолет с предварительно покрытых частиц
Частицы должны быть загружены в виде сухого порошка в Tygon трубки инжекции частиц линий, подключенных к многообразию. Это трубы, которые должны храниться в сухом помещении при температуре 4 ° С, когда они не используются, могут быть повторно использованы в дополнительных экспериментов с теми же реагентами. Наша экспериментальная установка может обеспечить до двух различных реагентов в анализе через отдельные порты в многообразии.
- Очистите сушеные покрытием частиц из стекол, используя лезвие скольжения стеклянной крышкой или лезвием перед загрузкой их в линии трубы Tygon. Это Tygon трубы будут, характерные только для этого реагента, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Как вы нагрузки частиц, согнуть трубку в форме U близко к разъему, чтобы удержать частицы от распространения по всей трубы и сосредоточены рядом с разъемом. Возьмите частиц с небольшой шпатель или кусок сложенной весят бумаги, и загрузить около половины из них в трубки для каждой серии эмбрионов. Нажмите трубы при загрузке шаг к распространению частиц равномерно.
4. Подготовка животных
До и после поставку золота частицы, эмбрионы хранятся в стерильных искусственный водоем при комнатной температуре.
- Место эмбрионов, вентральной стороной вверх, в паз высеченных в квартире, 5 мм толщиной кусок из силиконовой резины (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) и анестезировать их в раствор 8% этанола в стерильной воде искусственного пруда ( младший эмбрионов на стадиях Е6-Е8 может оставаться в воде искусственного пруда, не этанола в течение всего эксперимента).
- Непосредственно перед съемкой частиц, снижение уровня ванной, чтобы раскрыть брюшной поверхности эмбрионы, удалив часть решения. Поместите лист папиросной бумаги с небольшой отверстие в середине на вершине ее стабилизировать его и хранить его поверхность от высыхания.
5. Доставка покрытых частиц в ткани-мишени
Один нагрузки частиц как правило, могут быть использованы на срок до десяти выстрелов, с одного выстрела обычно доставку порядка нескольких сотен частиц.
- Создание выстрела, открыв один из клапанов для 0,3 сек, при введении болюса частиц из соответствующей строки трубку в пушку.
- Нажмите трубы аккуратно между выстрелами выбить частицы из трубки стены и тем самым облегчить их введения в его потоке пушки.
- Для покрытия участка ткани интересов, несколько кадров могут потребоваться.
- После доставки частиц, место эмбрионов обратно в искусственный водоем, желательно одного эмбриона на лунку в мульти-луночного планшета.
6. Иммуноокраски и маркировки нейронов
Держите эмбрионы при комнатной температуре и в темноте в течение от 1 до 3 дней после доставки частиц, пока RNAi (или эктопической экспрессии) достигается. Затем выполнить одну из следующих процедур на опытных образцов и органы управления:
- В гибридизация для анализа на наличие или отсутствие мРНК Netrin. Дигоксигенин меченных пиявки netrin riboprobes гибридизуются целые эмбрионы пиявка.
- Иммуноцитохимическая на тест для Netrin белка и других белков, которые являются уникальными для нейронной ткани (таких как анти ацетилированного тубулина). Процедура проводится также и на весь монтажа эмбрионов.
- Микроинъекции липофильных красителей (DII и Дио) в отдельных нейронов, для красителя заполняет для обозначения полного беседки нейронов интерес (mechanosensory нейронов давление в нашем случае) в обработанных и сегментов контроля. Этот анализ проводится на живых эмбрионов (нетронутыми или расчлененный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой демонстрации мы использовали пневматический пистолет капиллярные для доставки золота частиц по ячейкам в небольших локализованных объема живых эмбрионов пиявки стучать в и нокдауна генов. Целевом регионе как правило, имеют диаметр ~ 150 мкм и частицы были обнаружены ~ 15 мкм примерно средняя глубина проникновения, которая регулируется в пределах от 0 до 50 мкм. Когда частицы были покрыты молекулами дсРНК фактора netrin руководством аксона, они вызвали отчетливо видны нокдауна от netrin выражение, которое произошло только в клетках, содержащих частицы. Частицы покрытые плазмиды, кодирующей индуцированной флуоресценции GFP в нервных клетках, когда они остановились в их ядер.
Мы показали вам, как пневматический пистолет капиллярной дает технику biolistic доставки новых возможностей, чтобы целевая микроскопические регионы ткани ограничено в трех измерениях и целенаправленной с высокой точностью, без выявляемых повреждений ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-р Майкл Бейкер за помощь в создании конструкций для генной нокаут в себе и для обеспечения покадровой фильмы растущей сенсорных проекций. Мы также хотели бы поблагодарить Вирджиния Vandelinder для оказания технической помощи с экспериментами пневматического пистолета.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
