Summary
このビデオでは、我々は新たな小型遺伝子銃を持つ生きている組織への試薬の正確な微粒子銃配信のための手順を示しています。我々は、単一セグメントの腹側体壁と神経節にdsRNAの分子を提供することで、ヒル胚における軸索ガイダンス分子ネトリンの発現をノックダウンされています。
Abstract
このビデオでは、我々は生きている組織への試薬の正確な微粒子銃配信のための空気圧キャピラリー銃の使用を示しています。我々は内部コントロールとして未処理のセグメントを残して、ヒル胚の選択されたセグメントに摂動の遺伝子発現パターンにプロシージャを使用します。
空気圧キャピラリー銃は、試料を開くことなく、開発の初期段階での細胞の内部の層に到達するために使用することができます。生体組織への物質のローカライズを導入する方法として、銃による遺伝子銃送達は、いくつかの利点があります：それは、高速、非接触および非破壊です。さらに、シングルキャピラリー銃は、異なる物質の独立した配信のために使用することができます。配達地域は、〜50から150ミクロンの横方向の寸法を持っていると、0〜50μmの間で調節可能である平均浸透深さ、周囲に15〜上程度を拡張できます。この配信は単一の細胞外注射を介して、または遺伝学的アプローチによるマイクロインジェクションし、全身のノックダウンによるノックダウンの間に中間の選択した場所にあるセルの限られた数を対象とすることができるという利点があります。
背側ドメインではないノックダウンまたは自然にある中央のニューロンによって、腹側体壁に表現されている軸索ガイダンス分子ネトリン、の式でノッキングの場合は、しかし、我々は、体壁にdsRNA又はプラスミド- DNAの分子を提供し、中枢神経節。 、（i）の特定のアッセイのための実験装置（加速圧力を調整する）の準備、（ⅱ）塗装ガンに被覆された粒子をロードするdsRNA又はDNAの分子と粒子、（III）：この手順は、次の手順が含まれます最大1アッセイ、（IV）の2つの試薬に（粒子の配信、（v）を標的組織（体壁または神経節）に被覆粒子の配信のために動物を準備し、そして（vi）の胚を処理して免疫染色、免疫組織化学と神経ラベリング）は2〜3日配達後、通常、結果を可視化する。
粒子がネトリンdsRNAをでコーティングされたとき、彼らは明らかに粒子のみを（通常は、細胞あたり1-2粒）を含む細胞内で発生したネトリン発現のノックダウン見える原因。粒子は、彼らが核で停止した神経細胞におけるプラスミドのエンコーディングEGFP誘起蛍光でコーティング。
Protocol
粒子は、dsRNA分子、DNAプラスミドや染料などの異なる試薬で被覆することができます。粒子の種類と直径が試薬と組織における標的細胞の深さに応じて選択される：より大きな粒子がさらに浸透するが、組織に何らかの損傷を与える可能性があります。
1。 dsRNAを被覆粒子の調製
- 氷の上で100％イソプロパノールを置きます。
- 100ミリリットル結合バッファーで、再懸5 mgの金粒子（平均粒径は1.6μmS1600ri、シーシェル技術、LLC）。解決策の準備ができたら、次の手順に進みます。
- 結合バッファーを100μlを添加して粒子溶液を希釈し、ボルテックスで軽く混和し、凝集を避けるために1-2分間超音波処理。
- dsRNAを/ siRNAの5 -10μgの（dsRNAは/ siRNAは〜1μg/μlの濃度に水に溶解する必要がある）を追加します。
- 2分間、室温でボルテックスし、休暇。 siRNAの飽和金粒子のこれらの濃度と時間間隔の結果。
- ペレット〜15秒のためのベンチトップ遠心機で〜2,500 rpmで遠心分離によるsiRNA導入/金微粒子複合体。
- 上清を除去し、穏やかにペレットの最小限の中断で750 mlの冷イソプロパノールを加える。簡単にスピンし、上清を取り除く。
- 100μlの冷100％イソプロパノールで金粒子を再懸濁し、次に粒子の凝集体を分割する（2-3パルス）バスの超音波処理で簡単に超音波処理。最後に、スライドガラスの上に懸濁粒子を注ぎ、室温で乾燥させます。
2。特定のアッセイのための実験セットアップの準備
- それぞれの銃は最高〜3mmまで〜50μmの最小値に至るまで、さまざまなノズルの開口径を持っています。銃のために使用される特定したがって、対象となる組織の面積に応じて選択されます。
- 彼の圧力は、一般的にアップ〜100μmの（より高い圧力はより深い粒子を提供することができます）に、標的細胞の組織の深さに調整されます。胚とノズルの先端間の距離はまた、空気中の金粒子緩い勢いとして、浸透の深さに影響を与えます。
3。プレコート粒子でガンをロードする
粒子は、マニホールドに接続されているタイゴンチューブの粒子注入ラインに乾燥粉末としてロードする必要があります。 4℃で使用していない時は、乾燥雰囲気で保管してくださいこのチューブは、、同じ試薬と追加の実験で再利用することができます。私たちの実験のセットアップは、マニホールド内の別のポートを介してアッセイ当たり二つの異なる試薬を供給することができます。
- タイゴンチューブのラインにそれらをロードする前にガラスのカバースリップまたはカミソリの刃のエッジを使用してスライドガラスから乾燥被覆粒子をこすり落とす。このタイゴンチューブは、クロスコンタミネーションを避けるためにのみこの試薬に固有になります。
- パーティクルをロードするように、全体チューブと集中に近いコネクタに沿って広がってからの粒子を保つために、コネクタの近くにU字状にチューブを曲げて。小さなヘラまたは折り畳んだ重量紙、及び胚の各シリーズのチューブに、それらの約半分の負荷を持つ粒子を拾う。均等に粒子を分散させるロードステップ中にチューブをタップします。
4。動物の準備
金粒子の配信の前後に、胚を室温で無菌人工池の水に保持されます。
- シリコーンゴム（Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）のフラット、5mmの厚切りに刻まれた溝に、上胚、腹側を置き、（無菌人工池の水の8％エタノール溶液中でそれらをanaesthetizeの段階で若い胚E6 - E8）は、実験を通してのないエタノールで人工池の水に残すことができます。
- すぐに粒子を撮影する前に、ソリューションの一部を除去することによって胚の腹側表面を明らかにする浴室のレベルを下げます。それを安定化させ、乾燥からその表面を保つために、その上に中央にカット小さな穴を持つ組織の一枚の紙を置きます。
5。標的組織への被覆粒子の配信
粒子の一つの負荷は通常、シングルショットでは通常、数百の粒子のために提供するとともに、最大10枚まで使用することができます。
- 銃に対応するチューブラインからの粒子のボーラス注入を引き起こして、0.3秒のための弁の1つを開くことにより、ショットを生成する。
- チューブ壁からの粒子を取り除くため、ガンの彼ストリームに彼らの注入を容易にするために、ショットの間静かにチューブをタップします。
- 興味の組織の領域をカバーするために、複数のショットが必要になることがあります。
- 粒子の配信後、マルチウェルプレートに1ウェルあたり好ましくは一つの胚、バック人工池の水の中に胚を置く。
6。免疫染色および神経ラベリング
RNAiのが（または異所性発現）が達成されるまで、粒子の配信後1〜3日間室温でと暗闇の中で胚を保つ。我々は、実験試料とコントロールに関する次のいずれかの手順を実行します。
- ネトリンのmRNAの有無についてのアッセイにin situハイブリダイゼーション 。ジゴキシゲニン標識リーチネトリンのリボプローブは、全体のリーチの胚にハイブリダイズさせる。
- ネトリン蛋白質と神経組織（例えば、抗アセチル化チューブリンなど）に固有の他のタンパク質のアッセイに免疫細胞化学 。手続きは、全マウント胚でも実行されます。
- 治療と制御セグメントへの関心のニューロン（私たちのケースでmechanosensory圧力ニューロン）の完全な喬木にラベルを付けるために色素が、いっぱいになるための単一の神経細胞への脂溶性色素 （DIIとDIO）、 のMicroinjections。このアッセイは、ライブ胚（無傷または切開）で実行されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このデモでは、ノックインにライブリーチ胚の小さなローカライズされた体積のセルに金粒子を提供し、遺伝子をノックダウンする空気圧キャピラリー銃を使用。対象地域は、一般的に約150μmおよび粒子の直径は、0から50μmの間で調整可能だったの平均浸透深さ約〜15μmを、発見されたていた。粒子は軸索ガイダンス因子ネトリンのdsRNA分子でコーティングされたとき、彼らは明らかにだけ粒子を含む細胞で発生したネトリン発現のノックダウン見える原因。粒子は、彼らが核で停止した神経細胞におけるコードするプラスミドのGFP誘起蛍光でコーティング。
空気圧キャピラリー銃が組織に検出可能な損傷を与えることなく、三次元的に閉じ込められ、高精度で標的組織の顕微鏡の領域をターゲットに、微粒子銃配信の技術に新しい機能が提供されてどのように我々はあなたを示している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我々は、ノックインと成長している感覚突起のタイムラプスムービーを提供するための遺伝子のために構造を生成する際に彼の助けのために博士はマイケルベイカーに感謝したいと思います。我々はまた、空気銃の実験と技術支援のためにバージニアVandelinderに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
