Summary
Neste vídeo, mostramos um procedimento para uma entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo com uma arma gene romance em miniatura. Estamos derrubando a expressão da molécula de orientação netrin axônio em embriões de sanguessuga, fornecendo moléculas de dsRNA na parede ventral do corpo e gânglios dos segmentos individuais.
Abstract
Neste vídeo, mostramos o uso de uma pistola pneumática capilar para a entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo. Nós usamos o procedimento de padrões de expressão gênica perturb em segmentos selecionados de embriões sanguessuga, deixando os segmentos não tratados como controles internos.
A pistola pneumática capilar pode ser utilizada para atingir camadas internas de células em estágios iniciais de desenvolvimento sem abrir o espécime. Como um método para a introdução de substâncias localizadas em tecidos vivos, a entrega biobalística com a arma tem várias vantagens: é rápido, sem contato e não-destrutivos. Além disso, uma arma única capilar pode ser utilizado para a entrega independente de substâncias diferentes. A região de entrega pode ter dimensões laterais de ~ 50-150 mm e se estende por ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que é ajustável entre 0 e 50 mm. Esta entrega tem a vantagem de ser capaz de atingir um número limitado de células em um local selecionado intermediário entre célula única derrubar por microinjeção e knockdown sistêmica através de injeções extracelular ou por meio de abordagens genéticas.
Para derrubar ou bater na expressão da molécula de orientação netrin axônio, que é naturalmente expresso por alguns neurônios centrais e na parede ventral do corpo, mas não o domínio do dorsal, nós entregamos moléculas de dsRNA ou DNA-plasmídeo na parede do corpo e gânglios central. Este procedimento inclui as seguintes etapas: (i) preparação da montagem experimental para um teste específico (ajustando a pressão de aceleração), (ii) revestimento das partículas com as moléculas de dsRNA ou DNA, (iii) o carregamento das partículas revestido na arma, até dois reagentes em um ensaio, (iv) preparar os animais para a entrega de partículas, (v) a entrega de partículas revestidas no tecido alvo (parede do corpo ou gânglios), e (vi) o tratamento dos embriões (imunohistoquímica de positividade, e neuronal rotulagem) para visualizar os resultados, geralmente 2 a 3 dias após o parto.
Quando as partículas foram revestidas com netrin dsRNA, que causaram claramente visível knock-down de netrin expressão que só ocorreu em células contendo partículas (geralmente, 1-2 partículas por célula). Partículas revestidas com uma codificação de fluorescência EGFP plasmídeo induzida em células neuronais quando pararam em seus núcleos.
Protocol
Partículas podem ser revestidos com reagentes diferentes, tais como moléculas de dsRNA, plasmídeos DNA ou corantes. O tipo eo diâmetro das partículas são escolhidos de acordo com o reagente e da profundidade das células-alvo no tecido: partículas maiores penetrar mais, mas pode causar algum dano ao tecido.
1. Preparação de partículas dsRNA revestido
- Coloque 100% isopropanol no gelo.
- Ressuspender 5 mg partículas de ouro (S1600ri, Seashell Technology, LLC; diâmetro médio 1,6 mm) em 100 ml de tampão de ligação. Quando a solução está pronto, continue para a próxima etapa.
- Diluir a solução de partículas, adicionando 100 ul de tampão de ligação, brevemente vórtice e sonicate por 1-2 min, para evitar aglomeração.
- Adicionar 5-10μg de dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA deve ser dissolvido em água a uma concentração de ~ 1μg/μl).
- Vortex e deixe em temperatura ambiente por 2 min. Estes resultados intervalo de concentração e tempo em siRNA saturada partículas de ouro.
- Pellet os complexos siRNA / ouro de partículas por centrifugação a 2.500 rpm ~ em uma centrífuga de bancada para ~ 15 seg.
- Remover o sobrenadante e adicionar 750 ml gentilmente isopropanol frio com mínima interrupção do sedimento. Girar rapidamente e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as partículas de ouro em 100 l frio isopropanol 100%, então sonicate brevemente em um sonicador banho (2-3 pulsos) para acabar com aglomerados de partículas. Passado, despeje a partículas em suspensão sobre uma lâmina de vidro e deixar secar à temperatura ambiente.
2. Preparando a instalação experimental para um teste específico
- Cada arma tem um diâmetro de abertura do bocal diferentes, variando de um mínimo de 50 ìm ~ até ~ 3mm. Específico a ser utilizado para a arma é, portanto, escolhidos de acordo com a área de tecido a ser alvo.
- A pressão Ele é ajustado para a profundidade no tecido das células-alvo, geralmente até ~ 100μm (pressões mais elevadas podem entregar as partículas mais profundo). A distância entre o embrião ea ponta do bico também afeta a profundidade de penetração, como momento de ouro partículas soltas no ar.
3. Carregando a arma com as partículas pré-revestidas
Partículas devem ser carregados como um pó seco no tubo tygon linhas de injeção de partículas ligado ao colector. Essa tubulação, que deve ser mantido em um ambiente seco, a 4 ° C, quando não em uso, pode ser re-utilizados em experimentos adicionais com os mesmos reagentes. Nossa configuração experimental pode fornecer até dois reagentes diferentes por ensaio através de portas separadas no coletor.
- Raspe as partículas secas revestido da lâmina pela beira de um lamínula de vidro ou uma lâmina de barbear antes de colocá-los na linha de tubos tygon. Este tubo tygon serão específicas apenas para este reagente para evitar a contaminação cruzada.
- Como você carregar as partículas, dobre o tubo em forma de U perto do conector, para manter as partículas se espalhe ao longo de toda a tubulação e concentrada perto do conector. Pegue as partículas com uma pequena espátula ou um pedaço de papel dobrado pesar e carregar cerca de metade deles no tubo para cada série de embriões. Toque no tubo durante a etapa de carregamento para espalhar as partículas uniformemente.
4. Preparação dos animais
Antes e após a entrega das partículas de ouro, os embriões são mantidos em água da lagoa artificial estéril à temperatura ambiente.
- Coloque os embriões, o lado ventral para cima, em um sulco esculpido em um apartamento, um pedaço cinco milímetros de espessura de borracha de silicone (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) e anestesiar-los em uma solução de etanol a 8% em água estéril lagoa artificial ( embriões em estágios mais jovens E6-E8 pode permanecer na água da lagoa artificial, sem o etanol durante todo o experimento).
- Imediatamente antes de disparar as partículas, menor o nível do banho de descobrir a superfície ventral dos embriões através da remoção de parte da solução. Coloque um pedaço de papel de seda com um pequeno buraco cortado no meio em cima dela para estabilizá-lo e para manter sua superfície de secagem.
5. Entrega de partículas revestidas em tecido-alvo
Uma carga de partículas geralmente pode ser usado por até dez tiros, com um único tiro normalmente cumprindo a ordem de algumas centenas de partículas.
- Gerar um tiro, abrindo uma das válvulas para 0,3 s, fazendo com que a injeção de um bolus de partículas a partir da linha correspondente na tubulação de arma.
- Toque suavemente o tubo entre os tiros para desalojar as partículas da parede tubulação e, assim, facilitar a sua injecção na corrente Ele da arma.
- Para cobrir a área de tecido de interesse, vários tiros podem ser necessárias.
- Após a entrega das partículas, coloque os embriões de volta à água da lagoa artificial, de preferência um embrião por bem em uma placa multi-bem.
6. Imunocoloração e rotulagem neuronal
Manter os embriões em temperatura ambiente e no escuro por 1 a 3 dias após a entrega de partículas, até RNAi (ou expressão ectópica) seja alcançado. Em seguida, realizar um dos procedimentos a seguir sobre as amostras experimentais e controles:
- Hibridização in situ de ensaio para a presença ou ausência de mRNA netrin. Marcada com digoxigenina riboprobes leech netrin são cruzados com embriões leech todo.
- Imunocitoquímica para ensaio para netrin proteínas e outras proteínas que são únicas para o tecido neuronal (como anti tubulina acetilada). O procedimento é realizado também em toda montagem embriões.
- Microinjeções de corantes lipofílicos (DII e Dio) em neurônios individuais, para tingir-enche de rotular os mandris completa dos neurônios de interesse (neurônios pressão mecanosensorial no nosso caso) nos segmentos de controle e tratados. Este ensaio é realizado em embriões vivos (intactos ou dissecado).
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Discussion
Nesta demonstração, utilizamos a pistola pneumática capilar para entregar partículas de ouro em células localizadas no volume pequeno de um embrião vivo para sanguessuga knock-in e knock-down genes. A região-alvo, geralmente tinha um diâmetro de ~ 150 mm e partículas foram encontrados ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que era ajustável entre 0 e 50 mm. Quando as partículas foram revestidos com moléculas de dsRNA do netrin fator de orientação axônio, eles causaram claramente visível knock-down de netrin expressão que só ocorreu em células contendo partículas. Partículas revestidas com uma codificação de fluorescência da GFP plasmídeo induzida em células neuronais quando pararam em seus núcleos.
Nós mostramos-lhe como a pistola pneumática capilar dá a técnica de biobalística de entrega uma nova capacidade, para atingir regiões microscópicas de um tecido confinados em três dimensões e é alvo de alta precisão, sem causar danos ao tecido detectável.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Baker pela sua ajuda na geração de construções para gene knock-in e por fornecer os filmes de lapso de tempo de crescer projeções sensoriais. Gostaríamos também de agradecer a Virginia Vandelinder de assistência técnica com os experimentos pistola pneumática.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
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