Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Summary

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waardoor de levering van DNA of andere macromoleculen in individuele cellen in intact weefsel, ook in vivo preparaten. Hier hebben we detail de procedure voor SCE van een fluorescente kleurstof of plasmide DNA in neuronen in de intacte hersenen van de Xenopus laevis kikkervisje.

Abstract

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waardoor de levering van DNA of andere macromoleculen in individuele cellen in intact weefsel, ook in vivo preparaten. Het duidelijk voordeel van deze techniek is dat de experimentele manipulaties kunnen worden uitgevoerd op individuele cellen terwijl het omliggende weefsel ongewijzigd, waardoor onderscheid cel-autonome effecten van die welke voortvloeien uit de wereldwijde behandelingen. In combinatie met geavanceerde in vivo imaging technieken, SCE van TL-markers maakt directe visualisatie van de cellulaire morfologie, de celgroei, en intracellulaire gebeurtenissen van tijdschalen variërend van seconden tot dagen. Hoewel deze techniek wordt gebruikt in een verscheidenheid van in vivo en ex vivo de voorbereidingen, hebben we deze techniek geoptimaliseerd voor gebruik in Xenopus laevis kikkervisjes. In deze video artikel hebben we detail de procedure voor SCE van een fluorescente kleurstof of plasmide DNA in neuronen in de intacte hersenen van de albino Xenopus kikkervisje. We bespreken ook methoden om rendement te optimaliseren, en tonen voorbeelden van levende twee-foton fluorescentie beeldvorming van neuronen fluorescent gelabeld door SCE.

Protocol

Apparatuur set-up:

1. De elektrische uitrusting die nodig is voor deze techniek is een stimulator, een oscilloscoop en een micropipet de houder uitgerust met een zilveren draad te worden ingevoegd in de micropipet. We meestal een Axon instrumenten Axoporator 800A stimulator te gebruiken, maar andere gemeenschappelijke stimulatoren, zoals de Grass-instrumenten SD9 stimulatoren zijn ook geschikt voor single-cell elektroporatie. De stimulator wordt aangesloten op de headstage, die raakvlakken met de zilveren draad elektrode te worden geplaatst in de glazen micropipet met een interne geleidende oplossing. De andere stekker van de stimulator is aangesloten op de oscilloscoop input, die ook de inbreng ontvangt van de kikkervisje externe grond. Het kikkervisje externe grond is gewoon een zilveren draad die blijft elektrotone contact met de kikkervisje tijdens de elektroporatie. Het circuit is compleet als de micropipet wordt in contact gebracht met het kikkervisje.
   
   
2. Enkele cel elektroporatie vereist een microscoop met een goed werkende afstand (ten minste 5 cm), omdat dit geeft ruimte om te manoeuvreren en laat de micropipet worden gebracht in een hoek van ongeveer 30-45 graden.

Fabricage van micropipetten:

De voorbereiding van geschikte micropipetten is een cruciale stap in dit protocol. De moeilijkheid ligt in het evenwicht een smalle punt (minder dan 1 uM in diameter) met een die niet gemakkelijk breken wanneer aanprikken van de weefsel. We hebben ook geconstateerd dat tips met een tapse hoek van meer dan 10 graden voorkeur zijn.

1. Bereid een getrokken glas micropipet met een tip diameter van minder dan 1 uM, en een tip taper hoek van meer dan 10 graden.
   1. Borosilicaatglas met een interne filament met een buitendiameter van 1,5 mm en de inwendige diameter van 0,75 mm is zeer geschikt voor dit doel.
      1. De relatief dik glas biedt een zekere mate van stijfheid van de tip.
      2. De interne filament is van belang bij het opstellen back-gevulde vloeistof naar de micropipet tip.
2. Fabricage van geschikte tips zal het vaak nodig een aantal wijzigingen op grond van waargenomen resultaten. Verschillende weefsels kan een tip met een iets andere vorm of tip diameter.

Single-cell elektroporatie protocol:

Voor nieuwe gebruikers, is het raadzaam om te beginnen met fluorescerende kleurstoffen dextran omdat, in tegenstelling tot genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten, kunnen ze meteen te zien onder epifluorescentie. Het gebruik van fluorescente kleurstoffen kan de gebruiker direct de locatie van de micropipet tip binnen het weefsel, en op elektroporatie geeft direct feedback over de vraag of de apparatuur goed is opgezet en of de micropipet tip geschikt is.

1. Vul micropipet met een oplossing van verbinding te geëlektroporeerd hetzij door middel van een laad-spuit of door back-vulling.
   1. Als met behulp van plasmide DNA, dat de steekproeven zijn endotoxine-vrij, en bij een concentratie tussen 1-2μg/ml, bereid in water.
   2. De concentratie van fluorescerende kleurstoffen dextran moet empirisch worden bepaald. We maken vaak gebruik van fluorescerende kleurstoffen in water verdund tot ongeveer 300μM.
   3. Typisch zijn de volumes van 0,5-1μl zijn voldoende.
   4. Voorafgaand aan het laden, even centrifuge oplossingen op hoge snelheid tot het bedrag van fijn puin getrokken in de micropipet, wat kan leiden tot verstoppingen te verminderen.
   5. Luchtbellen in de top vaak van invloed op de stroom en dient te worden verdreven door krachtig flicking de micropipet voorafgaand aan de montage op de headstage.
2. Plaats micropipet in de houder of headstage gemonteerd op een 3-assige micromanipulator. Zorg ervoor dat zilver draad elektrode wordt ingebracht in micropipet, en is in elektrotone contact met de interne oplossing.
3. Verdoven kikkervisjes door onderdompeling in 0,02% MS-222 (3-aminobenzoëzuur ethyl ester), opgesteld in kikkervisje fokken medium (Steinberg's oplossing, pH 7,4).
   1. We normaal gesproken gebruik van het podium 44-48 albino Xenopus laevis kikkervisjes in onze experimenten.
   2. Kikkervisjes zijn meestal volledig verdoofd na ongeveer 5 minuten.
   3. Meerdere kikkervisjes kunnen gelijktijdig onder narcose worden om te wachten-time te verminderen, maar vermijd blootstelling aan MS-222 voor de periode na 1 uur.
4. De overdracht van een enkel verdoofd kikkervisje tot elektroporatie kamer met behulp van een plastic overdracht micropipet.
   1. De elektroporatie kamer kan gemakkelijk worden gemaakt in eigen huis door carving een kikkervisje-vormige holte in een kleine Sylgard ® siliconen te blokkeren, en het invoegen van een zilveren aardedraad in de ruimte zoals dat het in elektrotone contact met de kikkervisje in de kamer.
5. Positie kikkervisje dorsale zijde naar boven met een vochtige kwast.
6. Laat de micropipet totdat het in contact komt met de huid, direct grenst aan de regio van belang.
   1. Targeting regio's met een dicht opeengepakte cellichamen sterk zal toenemen kans op een succesvolle elektroporatie.We meestal gericht op het kikkervisje optische Tectum.
   2. Breng de micropipet in een hoek van 30 tot 45 graden. Ondiepere trajecten maken de huid doorboren moeilijker, terwijl de steilere hoek vaak belemmeren een te bekijken.
7. Voortzetting van het verlagen van de micropipet zal in eerste instantie kuiltje van de huid, en dan door naar het onderliggende weefsel.
   1. Oppervlakkige cellen zijn voorkeur voor in vivo beeldvorming, en kunnen worden gericht door ervoor te zorgen dat de micropipet tip langzaam wordt verlaagd na kuiltjes van de huid.
8. Men moet voortdurend de micropipet weerstand een keer geplaatst in het weefsel. Bij gebruik van een Axoporator 800A (Axon Instruments), weerstanden van ongeveer 10-40MΩ optimaal zijn. Weerstand is een goede indicator van de vraag of de tip diameter is geschikt voor single-cell elektroporatie.
   1. Hoge micropipet weerstanden (> 100MΩ) zijn een indicatie van verstopt tips of micropipetten met tips die zijn te smal.
   2. Lage micropipet weerstanden (<10MΩ) zijn indicatief voor een tip diameter die te groot is, vaak een gevolg van een gebroken tip.
   3. Als u een stimulator die niet voorziet in een directe weerstand te meten, kan micropipet weerstand indirect gemeten door het observeren van de amplitude van de spanning pulsen gemeten door de oscilloscoop (hieronder besproken).
9. Van toepassing spanning trein.
   1. Voor plasmide DNA, treinen pols bleek te zijn het meest effectief bestaan ​​uit negatieve blokgolf pulsen 1ms in duur, afgeleverd op 300Hz met pulstrein duur van 500ms.
      1. De puls spanning wordt bepaald empirisch zodanig dat de amplitude van de pulsen gemeten op de oscilloscoop is tussen de 0,75 en 1.5μA.
   2. Voor fluorescerende kleurstoffen dextran, zijn positief blokgolf pulsen van 300μs duur geleverd op een frequentie van 300 Hz met een puls trein duur van 10ms.
      1. Net als bij het protocol voor DNA, is de puls spanning bepaald empirisch zodanig dat de amplitude van de pulsen gemeten op de oscilloscoop is tussen de 0,75 en 1.5μA.
      2. Bijkomende aanpassingen aan de stimulus parameters kunnen worden gemaakt op basis van het observeren van de resultaten van elektroporatie onder epifluorescentie.
         1. Als geëlektroporeerde cellen blijken dim, moet pulsparameters geleidelijk worden verhoogd tot cellen helderder.
         2. Aan de andere kant, als clusters van cellen gemarkeerd zijn, moeten pols parameters worden gereduceerd tot enkele cellen zijn gelabeld.
10. Trek micropipet, opnieuw in te voegen in een andere plaats binnen het weefsel, en toe te passen spanning trein.
    1. Ter verbetering van opbrengst, we meestal electroporate meerdere sites in elk halfrond van het kikkervisje optische Tectum met voldoende afstand om ervoor te zorgen dat de gelabelde cellen elkaar niet overlappen.
11. Breng de geëlektroporeerd kikkervisje in een container met opvoeding Steinberg oplossing.
    1. Kikkervisjes zal snel herstellen van anesthesie binnen een paar minuten.
12. Hetzelfde micropipet kan gebruikt worden voor tal van kikkervisjes. Het is belangrijk om voortdurend te observeren de amplitude van de pulsen waargenomen op de oscilloscoop.
    1. Als de puls amplitude blijft laag na aanzienlijke verhoging van de puls intensiteit is dit waarschijnlijk een gevolg van de tip wordt verstopt, vaak gezien als electroporating veel kikkervisjes in een vergadering.
       1. Een methode om een ​​kleine tip klomp los is aan een enkele positieve puls toe te passen na het inbrengen van de micropipet in het weefsel.
       2. Als de klomp niet kan worden verdreven, of verstopping regelmatig terugkomt, vervang dan de micropipet.
    2. Als de puls amplitude blijft zeer groot na een forse daling van de pols parameters, is dit een teken dat de tip heeft gebroken en moet worden vervangen.

Screening voor het succesvol geëlektroporeerde cellen:

1. Na de elektroporatie, zijn kikkervisjes gescreend op gelabelde cellen met behulp van een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.
2. In het geval van fluorescerende kleurstoffen, kan kikkervisjes worden gescreend na slechts 30 minuten na elektroporatie.
   1. Wij hebben echter gevonden dat langere tussenpozen worden geassocieerd met een lager achtergrond fluorescentie niveaus.
3. Voor genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, is screening meestal uitgevoerd ten minste 12 uur na de elektroporatie.
   1. Cellen die fluorescerende eiwitten zal blijven helderder te krijgen met de tijd, dus dim cellen kunnen opnieuw worden gescreend na een extra interval van 12-24 uur.
4. Kikkervisjes verdoofd zoals hierboven beschreven, geplaatst in een Sylgard ® kamer en afgedekt. Individuele kikkervisjes worden vervolgens onderzocht in het kader epifluorescentie.
   1. Merk op dat overmatige blootstelling aan epifluorescentie het licht zal resulteren in fototoxiciteit dat de gelabelde cel kan doden. Daarom is het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat cellen worden blootgesteld aan het TL-licht.
5. Keer terug naar kikkervisjes container met opvoeding Steinberg oplossing.

Discussion

Single-cell elektroporatie (SCE) is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van gen-functie en het uitvoeren van gerichte genetische manipulatie. De transparantie van de albino kikkervisje en de toegankelijkheid van de hersenen maken dit model systeem bij uitstek geschikt voor het visualiseren van neuronale groei en de intracellulaire gebeurtenissen binnen een levend organisme. SCE kan de visualisatie van de groei van een enkel neuron, en tot cel-autonome manipulaties uit te voeren binnen een anders ongewijzigd brein. Terwijl deze video artikel toont aan de procedure voor het single-cell elektroporatie in Xenopus laevis kikkervisjes, is deze techniek is gebruikt in andere organismen, en is ook gebruikt in de hippocampus plakjes en gedissocieerd celculturen.