Single Cell elektroporation in vivo i den intakta växande hjärnan

Summary

Encelliga elektroporation (SCE) är en specialiserad teknik som möjliggör leverans av DNA eller andra makromolekyler i enskilda celler i intakta vävnader, inklusive in vivo förberedelser. Här har vi detalj förfarandet för SCE av en fluorescerande färg eller plasmid-DNA till nervceller i den intakta hjärnan i Xenopus laevis grodyngel.

Abstract

Encelliga elektroporation (SCE) är en specialiserad teknik för leverans av DNA eller andra makromolekyler i enskilda celler i intakta vävnader, inklusive in vivo förberedelser. Den klara fördelen med denna teknik är att experimentella manipulationer kan utföras på enskilda celler medan den omgivande vävnaden oförändrad, vilket skiljer cell-autonoma effekter från dem som följer av den globala behandlingar. I kombination med avancerad in vivo avbildningstekniker, tillstånd SCE av fluorescerande markörer direkt visualisering av cellulära morfologi, celltillväxt, och intracellulära händelser under tidsskalor alltifrån sekunder till dagar. Även denna teknik används i olika in vivo och ex förberedelser vivo, har vi optimerat denna teknik för användning i Xenopus laevis grodyngel. I denna video artikeln detalj vi förfarandet för SCE av en fluorescerande färg eller plasmid-DNA till nervceller i den intakta hjärnan i albino Xenopus grodyngel. Vi diskuterar också metoder för att optimera avkastning och visar exempel av levande två-photon fluorescens avbildning av nervceller fluorescerande av SCE.

Protocol

Utrustning set-up: Den elektriska utrustning som krävs för denna teknik är en stimulator, ett oscilloskop och en mikropipett hållare försedd med en silvertråd för att föras in i mikropipetten. Vi använder vanligtvis en Axon instrument Axoporator 800A stimulator, men andra vanliga stimulatorer som Grass instrument SD9 stimulatorer lämpar sig också för encelliga elektroporation. Stimulatorn är ansluten till headstage som gränssnitt med silvertråd elektroden placeras innanför glaset mikropipett in…

Discussion

Encelliga elektroporation (SCE) är ett kraftfullt verktyg för att bestämma geners funktion och att utföra riktade genmanipulation. Öppenheten i albino grodyngel och tillgängligheten i hjärnan gör denna modell systemet idealiskt för att visualisera neuronala tillväxt och intracellulära händelser inom en levande organism. SCE tillåter visualisering av tillväxten av en enda neuron, och för att utföra cell-autonoma manipulationer inom en annars oförändrad hjärna. Även om denna video artikeln demonstrerar förfarandet för en…