L'électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Summary

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est une technique spécialisée qui permet la livraison d'ADN ou d'autres macromolécules dans les cellules individuelles au sein des tissus intacts, y compris dans les préparations in vivo. Ici, nous détaillons la procédure de SCE d'un colorant fluorescent ou de l'ADN plasmidique dans les neurones dans le cerveau intact du têtard de Xenopus laevis.

Abstract

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est une technique spécialisée permettant la livraison d'ADN ou d'autres macromolécules dans les cellules individuelles au sein des tissus intacts, y compris dans les préparations in vivo. L'avantage de cette technique est que les manipulations expérimentales peuvent être effectuées sur des cellules individuelles, tout en laissant les tissus environnants inchangée, distinguant ainsi cellulaire autonome des effets de ceux résultant de traitements globaux. Lorsqu'il est combiné à un stade avancé dans les techniques d'imagerie in vivo, la SCE de marqueurs fluorescents permet la visualisation directe de la morphologie cellulaire, la croissance cellulaire, et les événements intracellulaires sur des périodes variant de quelques secondes à quelques jours. Bien que cette technique est utilisée dans une variété de préparations in vivo et ex vivo, nous avons optimisé cette technique pour une utilisation chez les têtards de Xenopus laevis. Dans cet article, vidéo, nous détaillons la procédure de SCE d'un colorant fluorescent ou de l'ADN plasmidique dans les neurones dans le cerveau intact de l'albinos têtard de Xenopus. Nous discutons également des méthodes pour optimiser le rendement, et de montrer des exemples de vivre à deux photons imagerie de fluorescence des neurones marqués par fluorescence par SCE.

Protocol

Matériel mis en place:

1. L'équipement électrique nécessaire pour cette technique sont un stimulateur, un oscilloscope et un porte micropipette équipé d'un fil d'argent pour être inséré dans la micropipette. Nous utilisons généralement une Axon Instruments Axoporator 800A stimulateur, cependant d'autres stimulateurs communs tels que les instruments d'herbe SD9 stimulateurs sont également appropriés pour une seule cellule électroporation. Le stimulateur est connecté à l'headstage, qui s'interface avec l'électrode de fil d'argent pour être placé à l'intérieur de la micropipette de verre contenant une solution interne d'orchestre. L'autre fil à partir du stimulateur est connecté à l'entrée de l'oscilloscope, qui reçoit également une entrée à partir du sol têtard externes. Le sol de têtard externe est simplement un fil d'argent qui reste en contact avec le têtard électrotonique cours électroporation. Le circuit est terminé une fois que la micropipette est mis en contact avec le têtard.
   
   
2. Électroporation cellule unique nécessite un microscope avec une bonne distance de travail (au moins 5 cm), car cela donne une marge de manœuvre et permet à la micropipette pour être portées à un angle d'environ 30-45 degrés.

La fabrication des micropipettes:

Préparation de micropipettes appropriée est une étape critique dans ce protocole. La difficulté réside dans l'équilibre une pointe étroite (moins de 1 um de diamètre) par un autre qui ne sera pas facilement se casser lors de perforer le tissu. Nous avons également constaté que les conseils d'un angle de conicité de plus de 10 degrés sont préférables.

1. Préparer une micropipette de verre tiré avec un diamètre de l'extrémité de moins de 1 um, et un angle de cône pointe de plus de 10 degrés.
   1. Verre borosilicate avec un filament interne avec diamètre extérieur de 1,5 mm de diamètre et interne de 0,75 mm est bien adapté à cet effet.
      1. Le verre relativement épais offre un degré de rigidité à la pointe.
      2. Le filament interne est importante dans l'élaboration remblayées fluide vers la pointe micropipette.
2. La fabrication des conseils adaptés nécessitera souvent plusieurs modifications en fonction des résultats observés. Différents tissus peuvent exiger une astuce avec une forme légèrement différente ou diamètre de la pointe.

Protocole d'électroporation à cellule unique:

Pour les nouveaux utilisateurs, il est conseillé de commencer avec des colorants fluorescents dextrane puisque, contrairement codées génétiquement des protéines fluorescentes, elles peuvent être immédiatement vu sous épifluorescence. L'utilisation de colorants fluorescents permet à l'utilisateur de voir directement l'emplacement de la pointe micropipette dans le tissu, et sur l'électroporation donne un feedback instantané de savoir si le matériel a été correctement mis en place et si la pointe micropipette est approprié.

1. Remplissez micropipette avec une solution de composé à électroporées soit en utilisant une seringue de chargement ou par rétro-remplissage.
   1. Si en utilisant l'ADN plasmidique, s'assurer que les échantillons sont exemptes d'endotoxines, et à une concentration comprise entre 1-2μg/ml, préparée dans de l'eau.
   2. La concentration des colorants fluorescents dextran doit être déterminée empiriquement. Nous utilisons souvent des colorants fluorescents dilué dans l'eau à environ 300 um.
   3. Typiquement, les volumes de 0,5-1 microlitre sont suffisantes.
   4. Avant le chargement, centrifuger brièvement des solutions à haute vitesse afin de réduire la quantité de particules de débris entraînés dans la micropipette, qui peut conduire à l'obstruction.
   5. Les bulles d'air au sein de la pointe affectent souvent la circulation du courant et doit être vigoureusement délogé par la micropipette pichenette avant de monter sur le headstage.
2. Insérer dans le titulaire ou micropipette headstage montée sur un micromanipulateur à 3 axes. Assurez-vous que l'électrode de fil d'argent est inséré dans la micropipette, et est en contact avec la solution électrotonique interne.
3. Anesthetize têtards par immersion dans 0,02% de MS-222 (3-amino-ester éthylique d'acide), préparé dans le milieu de l'élevage des têtards (solution de Steinberg, pH 7,4).
   1. Nous utilisons normalement stade de 44 à 48 albinos têtards Xenopus laevis dans nos expériences.
   2. Les têtards sont généralement totalement anesthésié après environ 5 minutes.
   3. Plusieurs têtards peuvent être anesthésiés simultanément à réduire les temps d'attente, cependant, éviter l'exposition au MS-222 pour des périodes supérieures à 1 heure.
4. Transfert à un têtard seule anesthésié pour chambre d'électroporation en utilisant une micropipette de transfert en plastique.
   1. La chambre d'électroporation peut être facilement faite en interne par la sculpture d'une cavité en forme de têtard dans une petite Sylgard ® bloc de silicone, et l'insertion d'un fil de terre d'argent dans la cavité de telle sorte qu'il sera en contact avec le têtard électrotonique dans la chambre.
5. Côté têtard position dorsale jusqu'à l'aide d'un pinceau imbibé.
6. Abaissez la micropipette jusqu'à ce qu'il soit en contact avec la peau, directement adjacent à la région d'intérêt.
   1. Cibler les régions où les corps cellulaires denses va grandement augmenter les chances de succès électroporation.Nous généralement cibler les têtards tectum optique.
   2. Apportez la micropipette dans un angle de 30 à 45 degrés. Profondes trajectoires font perforation de la peau plus difficile, tandis que des angles plus raides souvent obstacle à sa vue.
7. Poursuite de la descente micropipette initialement fossette de la peau, puis passer à travers dans le tissu sous-jacent.
   1. Les cellules superficielles sont préférés pour l'imagerie in vivo, et peut être ciblée en s'assurant que la pointe de micropipette est abaissé lentement sur ​​capitons de la peau.
8. Il faut surveiller constamment la résistance micropipette une fois placé dans le tissu. Si vous utilisez un Axoporator 800A (Axon Instruments), les résistances d'environ 10 40MΩ sont optimales. La résistance est un bon indicateur du fait que le diamètre de l'extrémité est approprié pour une seule cellule électroporation.
   1. Résistances micropipette élevée (> 100MΩ) sont révélateurs de conseils bouché ou micropipettes avec des conseils qui sont trop étroits.
   2. Résistances micropipette faible (<10MΩ) sont révélateurs d'un diamètre de la pointe qui est trop grand, souvent en raison d'une pointe cassée.
   3. Si vous utilisez un stimulateur qui ne fournit pas une mesure directe de résistance, la résistance micropipette peut indirectement mesurés en observant l'amplitude des impulsions de tension mesurée par l'oscilloscope (voir ci-dessous).
9. Appliquer le train de tension.
   1. Pour l'ADN plasmidique, trains d'impulsions jugés les plus efficaces consistent en impulsions négatives onde carrée 1ms dans la durée, livré à 300Hz avec une durée de trains d'impulsions de 500ms.
      1. La tension d'impulsion est déterminée empiriquement telles que l'amplitude des impulsions mesurée sur l'oscilloscope est entre 0,75 et 1.5μA.
   2. Pour les colorants fluorescents dextrane, positif impulsions d'ondes carrées d'une durée de 300μs sont livrés à une fréquence de 300Hz avec la durée de trains d'impulsions de 10ms.
      1. Comme avec le protocole pour l'ADN, la tension d'impulsion est déterminée empiriquement telles que l'amplitude des impulsions mesurée sur l'oscilloscope est entre 0,75 et 1.5μA.
      2. Ajustements supplémentaires pour les paramètres de stimulation peuvent être fondées sur l'observation des résultats de l'électroporation en épifluorescence.
         1. Si les cellules électroporées apparaissent sombres, les paramètres d'impulsion doit être progressivement augmentée jusqu'à cellules paraissent plus vives.
         2. D'autre part, si des groupes de cellules sont marquées, les paramètres d'impulsion doit être réduite jusqu'à des cellules individuelles sont étiquetés.
10. Rétracter micropipette, ré-insérer dans un site différent dans le tissu, et d'appliquer le train de tension.
    1. Pour améliorer le rendement, nous avons généralement électroporation plusieurs sites dans chaque hémisphère du tectum optique de têtard, avec un espacement suffisant pour garantir que les cellules marquées ne se chevauchent pas.
11. Transfert du têtard électroporés dans un récipient avec une solution d'élevage de Steinberg.
    1. Les têtards vont rapidement se remettre de l'anesthésie en quelques minutes.
12. La micropipette même chose peut être utilisé pour de nombreux têtards. Il est important de constamment observer l'amplitude des impulsions observées sur l'oscilloscope.
    1. Si l'amplitude d'impulsion reste faible après augmentant significativement l'intensité des impulsions cela est probablement le résultat de la pointe étant bouché, souvent vu lors de nombreux têtards électroporation en une seule séance.
       1. Une méthode pour déloger un sabot astuce mineure consiste à appliquer une impulsion positive unique après insertion de la micropipette dans le tissu.
       2. Si le bouchon ne peut être délogé, ou le colmatage retrouve souvent, de remplacer la micropipette.
    2. Si l'amplitude d'impulsion reste très important, après diminuant significativement les paramètres d'impulsion, c'est un signe que la pointe a cassé et doit être remplacé.

Le dépistage de cellules succès électroporées:

1. Après électroporation, les têtards sont projetés pour les cellules marquées à l'aide d'un microscope à épifluorescence debout.
2. Dans le cas de colorants fluorescents, les têtards peuvent être contrôlés, après aussi peu que 30 minutes après l'électroporation.
   1. Nous avons trouvé, cependant, que des intervalles plus longs sont associés à des bas niveaux de fluorescence de fond.
3. Pour codées génétiquement des protéines fluorescentes, le dépistage est habituellement effectuée au moins 12 heures après l'électroporation.
   1. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes continueront d'obtenir plus lumineux avec le temps, donc les cellules sombres peuvent être ré-examinés après un intervalle supplémentaire de 12-24 heures.
4. Les têtards sont anesthésiés comme décrit ci-dessus, placé dans une chambre Sylgard ® et lamelle. Têtards individuels sont ensuite examinés sous épifluorescence.
   1. Notez que l'exposition excessive à la lumière épifluorescence se traduira par la phototoxicité qui peut tuer les cellules marquées. Par conséquent, de minimiser la quantité de temps que les cellules sont exposées à la lumière fluorescente.
5. Retour aux têtards contenant une solution de l'élevage de Steinberg.

Discussion

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est un outil puissant pour déterminer la fonction des gènes et l'exécution ciblée des manipulations génétiques. La transparence du têtard albinos et l'accessibilité du cerveau font de ce système modèle idéal pour la visualisation de la croissance neuronale et des événements intracellulaires au sein d'un organisme vivant. SCE permet la visualisation de la croissance d'un seul neurone, et d'effectuer des manipulations de cellules-autonome au sein d'un cerveau contraire inchangée. Bien que cet article vidéo démontre la procédure pour une seule cellule d'électroporation dans les têtards de Xenopus laevis, cette technique a été utilisée dans d'autres organismes, et a également été utilisé dans des coupes d'hippocampe et des cultures de cellules dissociées.