Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Здесь мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми Xenopus laevis головастика.
Abstract
Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Явное преимущество этого метода в том, что экспериментальные манипуляции могут быть выполнены на отдельные клетки, оставляя окружающую ткань без изменений, тем самым проводя различие клеточной автономных эффектов от тех, в результате глобального лечения. В сочетании с передовыми в естественных методов визуализации, SCE флуоресцентных маркеров позволяет прямой визуализации клеточной морфологии, рост клеток и внутриклеточных событий за сроки от нескольких секунд до нескольких дней. Хотя эта техника используется в разнообразных в естественных условиях и экс подготовки естественных условиях, мы оптимизировали эту технику для использования в Xenopus laevis головастиков. В этом видео статье мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми альбиноса Xenopus головастика. Мы также обсудим методы для оптимизации доходности и показать примеры жить двухфотонной флуоресценции нейронов флуоресцентно помеченных SCE.
Protocol
Оборудование установки: Электротехническое оборудование, необходимое для этой техники стимулятор, осциллограф, и микропипетки держатель оснащен серебряную проволоку для вставки в микропипетки. Обычно мы используем инструменты Axon Axoporator 800A стимулятор, однако другие общие стимул…
Discussion
Одноклеточный электропорации (SCE) является мощным инструментом для определения функций генов и выполнение целевых генетических манипуляций. Прозрачность альбиноса головастика и доступности мозга делают эту модель системы идеально подходят для визуализации нейронных роста и внутриклеточных с?…
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Шармин Хоссейн для покадровой съемки фильма рост незрелых нейронов и Дерек Данфилд для электронных изображений микроскопии SCE советы micromicropipette.
Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain. J. Vis. Exp. (17), e705, doi:10.3791/705 (2008).