La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo
Summary
Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. Aquí detallamos el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los renacuajos Xenopus laevis.
Abstract
Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. La ventaja de esta técnica es que la manipulación experimental se puede realizar en las células individuales, dejando el tejido circundante sin alterar, por lo tanto distinguir células autónomas efectos de los resultantes de los tratamientos globales. Cuando se combina con avanzadas técnicas de imagen en vivo, SCE de marcadores fluorescentes permite la visualización directa de la morfología celular, el crecimiento celular, y eventos intracelulares en escalas de tiempo que van desde segundos a días. Si bien esta técnica se utiliza en una variedad de preparaciones en vivo y ex vivo, hemos optimizado esta técnica para su uso en los renacuajos Xenopus laevis. En este artículo de vídeo, se detalla el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los albinos renacuajos Xenopus. También se discuten los métodos para optimizar el rendimiento, y mostrar ejemplos de vida de dos fotones de imágenes de fluorescencia de las neuronas marcados con fluorescencia por SCE.
Protocol
Discussion
Una sola célula de electroporación (SCE) es una poderosa herramienta para determinar la función del gen y la realización de la manipulación genética dirigida. La transparencia de los renacuajos albinos y la accesibilidad del cerebro hacen que este sistema modelo ideal para la visualización de crecimiento neuronal y eventos intracelulares en un organismo vivo. SCE permite la visualización del crecimiento de una sola neurona, y para llevar a cabo por células autónomas manipulaciones dentro de un cerebro de otra manera inalterada. Si…
Acknowledgements
Los autores agradecen a Sharmin Hossain para el crecimiento de películas de lapso de tiempo la captura de inmaduros neurona y Dunfield Derek para las imágenes de microscopía electrónica de SCE consejos micromicropipette.
References
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).
- Dunfield, D., Haas, K. Single cell electroporation. Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , .
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
