Summary
Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.
Abstract
Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador.
Protocol
Dividir células estaminais embrionárias humanas (hESCs) semeadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs)
Normalmente uma placa CTEh confluentes podem ser divididos 01:06 - 01:10, dependendo da linha CTEh particular. A placa vai se tornar confluentes dividir novamente 5-7 dias após a divisão.
- Dois dias antes de se separarem, gelatinizar placas usando uma solução 0,1% de gelatina. Para uma placa de 6 poços, adicionar 2 ml em cada placa bem e incubar a 37 ° C, 5% CO 2 de cultura de tecidos incubadora durante a noite.
- Placa MEFs em 6-gelatinizado bem pratos do dia antes de o plano de dividir o hESCs. (NOTA: MEFs pode ser banhado até 3 dias antes, se necessário Após a 3 dias, MEFs-se mais planas e mais espalhadas, e não pode sustentar hESCs bem como calouro MEFs pode..) Pegue um frasco de g-irradiado ou mitomicina C tratados CF1 MEFs, contendo 5-6 x 10 6 células, a partir de nitrogênio líquido e descongelamento por 2 min em banho-maria a 37 ° C. Lave as células uma vez com o Media MEF quente Cultura em um tubo falcon de 50ml e ressuspenda no volume final de Meios de Cultura quente MEF. Em 5-6 x 10 6 células, isso é suficiente para placa de duas ou três placas de 6-bem.
- Enquanto o MEFs estão sendo lavados, retire as placas gelatinizado, remover toda a solução dos poços e adicionar 2,5 ml de Meios de Cultura MEF por poço.
- Adicionar 0,5 ml de suspensão por poço MEF para alcançar 3ml como um volume final em cada poço. Certifique-se de MEFs são uniformemente dispersas e placas lugar de volta na incubadora durante a noite para resolver.
- No dia da divisão CTEh, prepare frescos ou use <2 semanas de idade estéril colagenase solução IV em 1mg/ml. Remova toda a mídia dos poços CTEh você quer dividir, lave uma vez com 2 ml por poço de 1 × quente PBS, pH 7,4, e adicionar 1 ml de solução de colagenase IV. Incubar a 37 ° C por 5-10 min. Pegue a placa CTEh 6-bem fora da incubadora e adicionar 1 ml de ES mídia (sem bFGF) a cada poço. Usando a solução em cada poço, com uma pipeta de 1ml sugar até a mídia e soprar as células-tronco fora da placa. Para cada bem isso vai levar cerca de 5 a 10 repetições. Em seguida, transfira a hESCs suspenso em um tubo falcon 50ml. Faça isso para todos os poços, sendo dividido e se combinam em um tubo falcon 50ml. Pellet o hESCs a uma temperatura de 200g por 5 min e lave uma vez com a mídia ES faltando bFGF.
- Enquanto o hESCs estão sendo lavados, retire as placas MEF, remova toda a mídia dos poços e lavar uma vez com estéril, morna 1 × PBS, pH 7,4, em seguida, adicionar 2,5 ml de ES mídia (agora suplementado com 10 ng / ml bFGF) por também.
- Ressuspender o hESCs peletizadas em um volume adequado de mídia ES, suplementado com 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma o volume de ressuspensão depende da relação de divisão) cuidadosamente pipeta suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniformes, mas não tanto que as células individuais ou colônias muito pequenas são gerados. Adicionar 0,5 ml de suspensão CTEh por poço para as placas MEF para atingir 3 ml como volume final em cada poço. Visualmente certifique-se que o hESCs são distribuídas uniformemente, antes de colocar as placas de volta na incubadora durante a noite para resolver. Após o plaqueamento, ele geralmente levam alguns dias para colônias de assumir a sua forma característica e aparência fronteira.
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Discussion
Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Na última etapa antes do plaqueamento, quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma. Pipeta com cuidado a suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniforme, mas não tanto que as células individuais ou colônias são muito pequenas manchas generated.Immunofluorescence e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como out- 4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado durante a cultura.
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Acknowledgments
Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
