Summary
Denna video visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler. Del 1 av 3.
Abstract
Denna video visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler.
Protocol
Dela upp mänskliga embryonala stamceller (hESCs) pläterade på möss embryonala fibroblaster (MEFs)
Vanligtvis ett sammanflytande hESC platta kan delas 1:06 till 01:10, beroende på den särskilda hESC linjen. Uppdelningen plattan blir konfluenta igen 5-7 dagar efter klyvning.
- Två dagar före delning, gelatinize plattor med hjälp av en 0,1% gelatin lösning. För en 6-brunnar, lägg 2 ml i varje brunn och inkubera plattan i 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodling inkubator natten.
- Tavla MEFs på gelatiniserad 6-brunnars plattor dagen innan du planerar att dela upp hESCs. (OBS: MEFs kan vara klädd så många som tre dagar tidigare om det behövs Efter ~ 3 dagar MEFs blir plattare och mer utspridda och inte kan upprätthålla hESCs liksom fräschare MEFs kan..) Ta en flaska med g-bestrålade eller mitomycin C behandlas CF1 MEFs, med 5-6 x 10 6 celler, från flytande kväve och tina i 2 min i en 37 ° C vattenbad. Tvätta cellerna en gång med varmt Media MEF kultur i en 50ml falk rör och återsuspendera i den sista volymen av varmt Media MEF kultur. Vid 5-6 x 10 6 celler, är detta tillräckligt för att platta två eller tre 6-brunnars plattor.
- Medan MEFs håller på att tvättas, ta ut gelatiniserad plattor, ta bort alla lösning från brunnarna och tillsätt 2,5 ml av MEF Odlingsmedia per brunn.
- Tillsätt 0,5 ml MEF suspension per brunn för att uppnå 3ml som en slutlig volym i varje brunn. Se MEFs är jämnt spridd och tallrikar placera tillbaka i inkubatorn natten att lösa.
- På dagen för hESC dela, bered nya eller använda <2 veckor gamla steril kollagenas IV lösning på 1mg/ml. Ta bort allt material från hESC brunnar du vill dela, tvätta en gång med 2 ml per brunn av varmt 1 × PBS, pH 7,4, och lägga till 1 ml kollagenas IV lösning. Inkubera vid 37 ° C i 5-10 min. Ta 6-väl hESC platta ut ur kuvösen och lägga till 1 ml ES medier (utan bFGF) i varje brunn. Med hjälp av lösningen i varje brunn, med en 1 ml pipett suga upp medierna och blåsa stamceller bort av plattan. För varje väl detta tar cirka 5 till 10 repetitioner. Sedan överför de suspenderade hESCs till en 50 ml falk rör. Gör detta för alla de brunnar splittras och kombineras i en 50ml falk tub. Pelletera hESCs i rumstemperatur vid 200g i 5 minuter och tvätta en gång med ES-medier saknas bFGF.
- Medan hESCs håller på att tvättas, ta ur MEF plattor, ta bort allt material från brunnarna och tvätta en gång med steril, varm 1 × PBS, pH 7,4 och tillsätt därefter 2,5 ml ES media (nu kompletterad med 10 ng / ml bFGF) per väl.
- Resuspendera pelleterat hESCs i en lämplig volym av ES media, kompletterat med 10ng/ml bFGF. (OBS:.. När hESCs är återsuspenderade bör de vara av ungefär enhetlig koloni storlek och form på resuspension volymen beror på delningsförhållande) försiktigt Pipettera hESC fjädring upp och ner några gånger för att göra kolonierna mindre och mera enhetlig, men inte så mycket att enskilda celler eller mycket små kolonier genereras. Tillsätt 0,5 ml hESC suspension per brunn till MEF plattorna för att uppnå 3 ml som en slutlig volym i varje brunn. Kontrollera visuellt för att säkerställa att de hESCs fördelas jämnt innan du lägger plattorna tillbaka i inkubatorn natten att lösa. Efter förkromning tar det vanligtvis några dagar för kolonier att ta sin karakteristiska form och gränsen utseende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler. I det sista steget innan plätering, när hESCs är återsuspenderade bör de vara av ungefär enhetlig koloni storlek och form. Försiktigt Pipettera hESC fjädring upp och ner några gånger för att göra kolonierna mindre och mer enhetlig, men inte så mycket att enstaka celler eller mycket små kolonier är generated.Immunofluorescence färgning och mikroskopi eller flödescytometri för hESC pluripotens markörer, såsom okt- 4 och SSEA-4, behövs för att bekräfta underhåll av hESCs i en odifferentierad tillstånd under kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar medlemmar i de allmänna Centrum för regenerativ medicin och stamcellsforskning vid UCLA, speciellt Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, och medlemmar av UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility för deras stöd för våra studier.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
