Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الجنينية الماوس الليفية التغذية (MEF). جزء 1 من 3.
Abstract
هذا الفيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الجنينية الماوس الليفية التغذية (MEF).
Protocol
تقسيم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مطلي على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs)
عادة ما يمكن تقسيم اللوحة hESC متموجة 1:06 حتي 1:10 ، اعتمادا على الخط hESC معينة. وسوف تصبح لوحة تقسيم متموجة مرة أخرى 5-7 أيام بعد انفصالها.
- قبل يومين من تقسيم ، يهلم لوحات باستخدام محلول الجيلاتين 0.1 ٪. لوحة 6 - جيدا ، إضافة إلى 2ml كل لوحة وكذلك في احتضان 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الأنسجة حاضنة الثقافة بين عشية وضحاها.
- لوحة MEFs على لوحات 6 gelatinized جيدا في اليوم السابق كنت تخطط لتقسيم hESCs. (ملاحظة : يمكن مطلي MEFs ما يصل إلى 3 أيام في وقت سابق إذا لزم الأمر وبعد 3 أيام ~ ، MEFs أصبح أكثر انبساطا وأكثر انتشار التدريجي ، ولا يمكن إدامة hESCs فضلا أعذب MEFs يمكن.) خذ قنينة من المشع ، ز أو mitomycin يعامل C CF1 MEFs ، تحتوي على 5-6 × 10 6 خلايا ، من النيتروجين السائل وذوبان الجليد لمدة 2 دقيقة في حمام ماء C ° 37. يغسل مرة واحدة مع الخلايا الحارة الإعلام الثقافة MEF في أنبوب الصقر 50ml وresuspend في الحجم النهائي للالدافئة الإعلام الثقافة MEF. س 5-6 في الخلايا 6 10 ، وهذا هو ما يكفي ليومين أو ثلاثة لوحة 6 - جيدا لوحات.
- بينما يجري غسلها MEFs ، واخراج لوحات gelatinized ، إزالة كافة الحل من الآبار وإضافة 2.5 مل من الإعلام الثقافة MEF لكل بئر.
- إضافة 0.5 مل من تعليق MEF لكل بئر من أجل تحقيق 3ml كوحدة تخزين النهائي في كل بئر. تأكد منتشرة بالتساوي MEFs وألواح مكان مرة أخرى في حاضنة لتسوية بين عشية وضحاها.
- يوم تقسيم hESC ، وإعداد الطازجة أو استخدام <2 أسابيع العقيمة حل رابعا في كولاجيناز 1mg/ml. إزالة كافة وسائل الإعلام من الآبار hESC تريد تقسيمها ، ويغسل مرة واحدة مع 2ml لكل بئر من 1 الدافئة × PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وإضافة 1ml من حل رابعا كولاجيناز. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة. تأخذ لوحة hESC 6 - جيدا للخروج من الحاضنة وإضافة وسائل الإعلام 1ml ES (بدون bFGF) إلى كل بئر. باستخدام الحل في كل بئر ، مع 1ml ماصة تمتص وسائل الإعلام وتفجير الخلايا الجذعية الخروج من لوحة. لكل بئر وسوف يستغرق ذلك حوالي 5 إلى 10 مرات. ثم نقل hESCs علقت في أنبوب الصقر 50ml. نفعل ذلك لجميع الآبار يتم تقسيم والجمع في أنبوب واحد الصقر 50ml. بيليه وhESCs في درجة حرارة الغرفة في 200G لمدة 5 دقائق ويغسل مرة واحدة مع وسائل الإعلام التي تفتقر إلى وفاق bFGF.
- بينما يجري غسلها hESCs ، واخراج لوحات MEF ، وإزالة جميع وسائل الإعلام من الآبار ، ويغسل مرة واحدة مع معقمة ، دافئ 1 × PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ثم يضاف 2.5 مل من وسائل الإعلام ES (تستكمل الآن ب 10 نانوغرام / مل bFGF) لكل جيدا.
- Resuspend في hESCs مكعبات في حجم مناسب من وسائل الاعلام وفاق ، على أن تستكمل مع bFGF 10ng/ml. (ملاحظة : عندما تكون معلق على hESCs ، فإنها ينبغي أن تكون ذات حجم مستعمرة موحدة تقريبا وشكل حجم إعادة تعليق يعتمد على نسبة تقسيم) بعناية ماصة تعليق hESC صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل المستعمرات أصغر حجما وأكثر اتساقا ، ولكن ليس الكثير من الخلايا التي يتم إنشاؤها واحد أو مستعمرات صغيرة جدا. إضافة 0.5 مل من تعليق hESC لكل بئر لوحات MEF لتحقيق 3 مل كوحدة تخزين النهائي في كل بئر. تحقق بصريا للتأكد من أن يتم توزيعها بالتساوي على hESCs قبل وضع لوحات مرة أخرى في حاضنة لتسوية بين عشية وضحاها. بعد الطلاء ، وسوف يستغرق عادة بضعة أيام لاتخاذ المستعمرات على شكلها سمة ومظهر الحدود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الفيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الجنينية الماوس الليفية التغذية (MEF). في الخطوة الأخيرة قبل الطلاء ، وعندما يتم معلق على hESCs ، ينبغي أن تكون مستعمرة موحدة تقريبا حجم والشكل. ماصة بعناية تعليق hESC صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل المستعمرات أصغر حجما وأكثر اتساقا ، ولكن ليس كثيرا أن الخلايا وحيدة أو مستعمرات صغيرة جدا هي تلطيخ generated.Immunofluorescence والخلوي المجهري أو تدفق للعلامات hESC تعدد القدرات ، مثل أكتوبر وهناك حاجة إلى 4 وSSEA - 4 ، لتأكيد الحفاظ على hESCs في حالة غير متمايزة خلال الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وتدعم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 - 00313. نشكر أعضاء المركز واسع في الطب التجديدي ، وأبحاث الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا ، وخصوصا الدكتور Amander كلارك ، والدكتور جيروم زاك ، وأعضاء معهد الجذعية في جامعة كاليفورنيا واسع مرفق الخلية الأساسية لدعمهم لدراساتنا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
