Summary
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर कोशिकाओं पर विकसित करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs). 3 के भाग 1.
Abstract
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर कोशिकाओं पर विकसित करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs).
Protocol
बंटवारे मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) पर चढ़ाया
आम तौर पर मिला हुआ hESC थाली 1:10 करने के लिए 1:6 हो विभाजित कर सकते हैं, विशेष hESC लाइन पर निर्भर करता है. विभाजन थाली मिला हुआ फिर से बंटवारे के बाद बन जाएगा 5-7 दिनों.
- बंटवारे से पहले दो दिन, एक 0.1% जिलेटिन समाधान का उपयोग कर प्लेटें सरेस लगाना. 6 अच्छी तरह से एक थाली के लिए, प्रत्येक और अच्छी तरह से सेते हैं थाली में एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर रातोंरात इनक्यूबेटर में 2ml जोड़ने.
- Gelatinized 6 अच्छी तरह से प्लेट पर प्लेट MEFs दिन पहले आप बंटवारे पर hESCs योजना. (ध्यान दें: MEFs 3 दिन पहले अगर जरूरत के रूप में कई के रूप में मढ़वाया जा सकते हैं ~ 3 दिनों के बाद, MEFs चापलूसी और प्रसार के बाहर अधिक और के रूप में अच्छी तरह के रूप में hESCs नवसिखुआ MEFs कर सकते हैं नहीं को बनाए रखने कर सकते हैं बनने के..) जी - विकिरणित या mitomycin की एक शीशी ले लो सी CF1 MEFs इलाज, 5-6 x 10 6 कोशिकाओं और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन पिघलना से, युक्त . कोशिकाओं को एक बार एक 50ml बाज़ ट्यूब में गर्म MEF संस्कृति मीडिया के साथ धो और गर्म MEF संस्कृति मीडिया के अंतिम मात्रा में resuspend. 5-6 x 10 6 कोशिकाओं में, यह दो या तीन प्लेटें 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पर्याप्त है.
- जबकि MEFs धोया जा रहे हैं, बाहर gelatinized प्लेटें ले, कुओं से सभी समाधान निकालने और MEF संस्कृति के प्रति में अच्छी तरह से मीडिया के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा के रूप में 3ml प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रति MEF निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. सुनिश्चित करें कि MEFs समान रूप से छितरी हुई है और जगह प्लेटें बसने रातोंरात इनक्यूबेटर में वापस.
- HESC बंटवारे के दिन, ताजा तैयार है या <2 हफ्ते पुरानी 1mg/ml पर बाँझ collagenase चतुर्थ समाधान का उपयोग करें. HESC कुओं आप विभाजित करना चाहते हैं से सभी मीडिया निकालें, 2ml प्रति अच्छी तरह से एक गर्म × पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ एक बार धोने, और collagenase चतुर्थ समाधान के 1ml जोड़ने. 37 डिग्री 5-10 मिनट के लिए सी सेते हैं. 6 अच्छी तरह इनक्यूबेटर hESC बाहर थाली ले लो और हर अच्छी तरह से ES मीडिया (bFGF बिना) के 1ml जोड़ने. प्रत्येक कुएं में एक 1ml विंदुक के साथ समाधान, का उपयोग मीडिया चूसना और स्टेम कोशिकाओं की थाली से दूर उड़ा. प्रत्येक अच्छी तरह से इस के बारे में 5 से 10 repetitions ले जाएगा. फिर, एक 50ml बाज़ ट्यूब में निलंबित कर दिया hESCs हस्तांतरण. सभी विभाजित किया जा रहा कुओं के लिए यह करो और एक 50ml बाज़ ट्यूब में गठबंधन. गोली 200g पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए और hESCs ES bFGF कमी मीडिया के साथ एक बार धोने.
- जबकि hESCs धोया जा रहे हैं, बाहर MEF प्लेटें ले, कुओं से सभी मीडिया को हटाने और के साथ एक बार धोने बाँझ, गर्म 1 × Pbs, 7.4 पीएच तो ES मीडिया के 2.5 मिलीलीटर (अब 10 एनजी / मिली bFGF के साथ पूरक) प्रति जोड़ने अच्छी तरह से.
- Resuspend ES मीडिया के एक उचित मात्रा में pelleted hESCs 10ng/ml bFGF के साथ पूरक. (नोट:: जब hESCs resuspended हैं, वे लगभग एक समान कॉलोनी आकार और आकार के resuspension मात्रा बंटवारे अनुपात पर निर्भर करता है चाहिए) ध्यान से विंदुक hESC निलंबन और नीचे एक बार कुछ कालोनियों छोटे और अधिक समान बनाने, लेकिन इतना है कि एकल कक्षों या बहुत छोटी कालोनियों उत्पन्न कर रहे हैं नहीं है. MEF प्लेटें hESC निलंबन प्रति अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा के रूप में 3 मिलीलीटर प्राप्त करने में जोड़ें. दिखने के लिए सुनिश्चित करें कि hESCs प्लेटें वापस इनक्यूबेटर में रातोंरात बसने के लिए रखने से पहले समान रूप से वितरित कर रहे हैं बनाने की जाँच करें. चढ़ाना के बाद, यह आमतौर पर कालोनियों के लिए एक कुछ दिनों लेने के लिए उनकी विशेषता आकार और सीमा उपस्थिति पर ले जाएगा.
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Discussion
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर कोशिकाओं पर विकसित करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs). चढ़ाना से पहले अंतिम चरण में, जब hESCs resuspended हैं, वे लगभग वर्दी कॉलोनी आकार और आकार की होना चाहिए. ध्यान से hESC निलंबन विंदुक ऊपर और नीचे एक बार कुछ कालोनियों छोटे और अधिक समान बनाने के लिए, लेकिन इतना नहीं है कि एकल कक्षों या बहुत छोटी कालोनियों generated.Immunofluorescence और hESC अक्टूबर - जैसे pluripotency मार्करों, के लिए माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry धुंधला कर रहे हैं 4 और SSEA-4, संस्कृति दौरान एक undifferentiated राज्य में hESCs के रखरखाव की पुष्टि करने के लिए की जरूरत है.
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Acknowledgments
Teitell प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल के अध्ययन से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) बीज अनुदान RS1 ००,३१३ द्वारा समर्थित हैं. हम पुनर्योजी चिकित्सा और UCLA, विशेष रूप से डॉ. Amander क्लार्क, डॉ. जेरोम जैक, और UCLA ब्रॉड संस्थान हमारे अध्ययन के उनके समर्थन के लिए स्टेम सेल कोर सुविधा के सदस्यों में स्टेम सेल रिसर्च के ब्रॉड केंद्र के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
