Summary
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки. Часть 1 из 3.
Abstract
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки.
Protocol
Разделение человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) высевают на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs)
Обычно сливной пластины чЭСК можно разделить 1:06 до 1:10, в зависимости от конкретной линии чЭСК. Раскол пластины станет сливной снова через 5-7 дней после расщепления.
- За два дня до расщепления, желировать пластин использованием 0,1% раствора желатина. Для 6-луночный планшет, добавьте 2 мл в каждую лунку и инкубируйте пластинку в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора культуры тканей в одночасье.
- Пластина MEFs на желатинизированный 6-луночных накануне вы планируете расщепления ЭСК. (ПРИМЕЧАНИЕ: MEFs могут быть покрыты целых 3 дня раньше, если это необходимо Через ~ 3 дня, MEFs становятся более плоскими и более расширенным, и не может поддерживать ЭСК, а также свежее MEFs может..) Возьмите пузырек с г-облученных или митомицин С рассматриваться CF1 MEFs, содержащий 5-6 х 10 6 клеток, из жидкого азота и оттаивания в течение 2 мин при 37 ° С водяной бане. Вымойте клетки раз теплой MEF культуры средств массовой информации в 50 мл трубки сокола и ресуспендируют в конечном объеме теплой медиа-культуры MEF. На 5-6 х 10 6 клеток, этого достаточно, чтобы пластины два или три 6-луночных планшетах.
- Хотя в настоящее время MEFs моют, вынимают желатинизированный плиты, удалите все решения из колодцев и добавить 2,5 мл MEF Культурное пространство на лунку.
- Добавить 0,5 мл суспензии в MEF также для достижения 3 мл в качестве конечного объема в каждую лунку. Убедитесь, что MEFs равномерно рассеяны и место пластин еще в инкубаторе ночь отстояться.
- В день чЭСК расщепления, готовить свежие или использовать <2 недельных стерильной коллагеназы IV решение в 1mg/ml. Удалите все носители из чЭСК скважин вы хотите разделить, мыть один раз с 2 мл на лунку теплой 1 х PBS, рН 7,4, и добавьте 1 мл раствора коллагеназы IV. Инкубировать при 37 ° С в течение 5-10 мин. Возьмите 6-а чЭСК пластины из инкубатора и добавить 1 мл ES СМИ (без bFGF) в каждую лунку. Использование раствора в каждую лунку, с 1 мл пипетки подлизываться СМИ и удар стволовых клеток от пластины. Для каждой лунки на это уйдет от 5 до 10 повторений. Затем перенесите приостановлено ЭСК в 50 мл трубки сокола. Сделайте это для всех скважин быть раскол и объединить в одной трубке 50мл сокола. Пеллет ЭСК при комнатной температуре в 200 г в течение 5 мин и мыть один раз со средствами массовой информации ES хватает bFGF.
- Хотя ЭСК в настоящее время моют, вынимают MEF плиты, удалите все носители из колодцев и мыть один раз стерильным, теплой 1 х PBS, рН 7,4 затем добавьте 2,5 мл ES средств массовой информации (в настоящее время с добавлением 10 нг / мл bFGF) в хорошо.
- Ресуспендируют гранулированный ЭСК в соответствующий объем средств массовой информации ES, дополненные 10ng/ml bFGF. (ПРИМЕЧАНИЕ:.. Когда ЭСК ресуспендируют, они должны быть примерно одинакового размера и формы колонии ресуспендирования объем зависит коэффициент разделения) Осторожно пипетки чЭСК подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы колонии меньше и более равномерным, но не так много, что отдельные клетки или очень небольшие колонии создаются. Добавить 0,5 мл суспензии в чЭСК хорошо MEF пластин для достижения 3 мл в качестве конечного объема в каждую лунку. Визуально проверить, чтобы убедиться, что ЭСК распределены равномерно до размещения пластин еще в инкубаторе ночь отстояться. После покрытия, оно, как правило, потребуется несколько дней для колоний взять на себя их характерной формы и границы внешний вид.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки. В последний шаг перед покрытием, когда ЭСК ресуспендируют, они должны быть примерно одинакового размера и формы колонии. Тщательно пипетки чЭСК подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы колонии меньше и более равномерным, но не так много, что отдельные клетки или очень маленькие колонии generated.Immunofluorescence окрашивание и микроскопия или проточной цитометрии для чЭСК плюрипотентности маркеры, такие как октябрь- 4 и SSEA-4, необходимы, чтобы подтвердить поддержания ЭСК в недифференцированном состоянии во время культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
