Summary
Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).
Abstract
Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).
Protocol
Dividir las células madre embrionarias humanas (hESCs) chapada en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
Por lo general, una placa de células madre confluentes se puede dividir 01:06-1:10, dependiendo de la línea de células madre en particular. La placa de división, confluyen de nuevo 5-7 días después de partir.
- Dos días antes de partir, gelatinizar las placas con una solución de gelatina al 0,1%. Para una placa de 6 pocillos, agregar 2 ml en cada pocillo de la placa y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejido durante la noche.
- Placa MEFs en gelatinizado placas de 6 pocillos el día antes de planificar sobre la división del hESCs. (NOTA: MEFs se puede platear hasta 3 días antes, si es necesario después de ~ 3 días, MEFs se vuelven más planos y más dispersa y no se puede sostener hESCs así como más fresco MEFs puede..) Tome un frasco de g-irradiados o mitomicina C tratados CF1 MEFs, que contiene 6.5 x 10 6 células, a partir de nitrógeno líquido y descongelación durante 2 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Lave las células una vez con los medios de comunicación cálida MEF Cultura en un tubo de 50 ml de halcón y resuspender en el volumen final de calentar el medio de MEF Cultura. En 5.6 x 10 6 células, esto es suficiente para la placa de dos o tres placas de 6 pocillos.
- Mientras que el MEFs se están lavando, sacar las placas gelatinizada, eliminar toda la solución de los pozos y añadir 2,5 ml de medios de cultivo MEF por pozo.
- Añadir 0,5 ml de suspensión por el MEF, así como para lograr 3 ml un volumen final en cada pocillo. Asegúrese de que MEFs son distribuidas uniformemente y coloque los platos de nuevo en la noche a la mañana para resolver la incubadora.
- El día de la división de células madre, preparar dulce o uso <2 semanas de edad estéril solución de colagenasa IV a 1mg/ml. Quite todos los medios de comunicación de los pozos de células madre que desea dividir, lavar una vez con 2 ml por pocillo de agua tibia 1 × PBS, pH 7,4, y añadir 1 ml de solución de colagenasa IV. Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos. Tome la placa de células madre 6-y fuera de la incubadora y añadir 1 ml de ES medios de comunicación (sin bFGF) a cada pocillo. Usando la solución en cada pozo, con una pipeta de 1 ml aspirar los medios de comunicación y de golpe las células madre fuera de la placa. Para cada bien esta será de unos 5 a 10 repeticiones. Entonces, la transferencia de la hESCs suspendido en un tubo de 50 ml de halcón. Hacer esto para todos los pozos que se divide y se combinan en un tubo Falcon de 50ml. Se precipitan los hESCs a temperatura ambiente a 200 g por 5 min y lavar una vez con los medios de comunicación carecen ES bFGF.
- Mientras que el hESCs se están lavando, sacar las placas MEF, quite todos los medios de comunicación de los pocillos y lavar una vez con agua estéril, tibia 1 × PBS, pH 7,4, a continuación, añadir 2,5 ml de ES medios de comunicación (ahora complementado con 10 ng / ml bFGF) por así.
- Resuspender el hESCs granulado en un volumen adecuado de los medios de ES, complementado con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Cuando el hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y la forma, el volumen de resuspensión depende de la relación de división) con cuidado la pipeta la suspensión células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniformes, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas se generan. Añadir 0,5 ml de suspensión de células madre por así a las placas MEF para lograr 3 ml en un volumen final en cada pocillo. Compruebe visualmente para asegurarse de que la hESCs se distribuyen uniformemente antes de colocar las placas de nuevo en la incubadora durante la noche a un acuerdo. Después de la siembra, por lo general se toman unos días de colonias a tomar su forma característica y apariencia de los bordes.
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Discussion
Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF). En el último paso antes de chapado, cuando la hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y forma. Pipeta cuidadosamente la suspensión de células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniforme, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas manchas generated.Immunofluorescence y citometría de flujo o microscopía de marcadores de células madre pluripotencia, tales como Oct- 4 y 4-SSEA, son necesarios para confirmar el mantenimiento de hESCs en estado indiferenciado en cultivo.
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Acknowledgments
Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell el apoyo de un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de amplias e Investigación de Células Madre de la UCLA, en especial el Dr. Amander Clark, el doctor Jerome Zack, y los miembros del Fondo para el UCLA amplio núcleo de célula madre Instituto por el apoyo de nuestros estudios.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).