Summary
Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.
Abstract
Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir.
Protocol
Yarma insan embriyonik kök hücreleri (hESC) fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) kaplanmıştır.
Genellikle konfluent hESC plaka özel hESC hattı bağlı, 1:10 1:6 bölünmüş olabilir. Split plaka bölme 5-7 gün sonra tekrar konfluent olacak.
- Bölme iki gün önce,% 0,1 jelatin çözüm kullanarak plakaları jelatinleştirmeye. 6 plaka için, bir gecede 37 ° C,% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör her iyi ve inkübe plaka içine 2ml ekleyin.
- Levha MEFS gün jelatinize 6-kuyucuğu bölünmesi üzerine hESC planı önce. (NOT: MEFS 3 gün önceki gerekirse birçok kaplama olması. ~ 3 gün sonra, MEFS düz ve yayılması-dışı fazla ve MEFS. HESC yanı sıra taze sürdürmek değil. Haline..) G-ışınlanmış veya mitomisin bir flakon atın C 37 ° C su banyosunda 2 dakika için sıvı azot ve çözülme, 5-6 x 10 6 hücre içeren, CF1 MEFS tedavi. 50ml şahin tüp sıcak MEF Kültür Medya ile bir kez hücreleri yıkayın ve sıcak MEF Kültür Medya nihai hacmi tekrar süspansiyon haline getirin. 5-6 x 10 6 hücre, bu yeterli plaka, iki ya da üç 6 kuyucuğu .
- MEFS yıkanmış olmasına rağmen, galveniz plakaları kuyulardan tüm çözüm kaldırmak ve de ortalama MEF Kültür Medya 2.5 ml.
- Her iyi bir son hacim olarak 3ml ulaşmak için de her MEF süspansiyon 0,5 ml ekleyin. MEFS inkübatör yerleşmek için bir gecede eşit dağınık ve yer plakaları emin olun.
- HESC bölme gününde, 1mg/ml az <2 hafta eski steril kollajenaz IV çözüm taze hazırlamak veya kullanmayın. HESC kuyulardan bölmek istediğiniz tüm medya çıkarın 2ml ortalama sıcak 1 × PBS, pH 7.4 ile bir kez yıkayın ve kollajenaz IV çözümü 1ml ekleyin. 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin. Kuluçka 6-iyi hESC plaka alın ve her bir kuyunun ES medya (bFGF olmadan) 1ml ekleyin. 1 ml pipet ile, her bir kuyu çözümü kullanarak medya emmek ve plaka kök hücreler kapalı darbe. Bu her bir kuyu için yaklaşık 5 ila 10 tekrar alacaktır. Sonra, askıya hESC 50ml şahin tüp içine aktarın. Bölünmüş olan bütün kuyuları için bunu yapın ve bir 50ml şahin tüp birleştirmek. Pelet 5 dakika boyunca 200 gr oda sıcaklığında hESC ve bFGF eksik ES medya ile bir kez yıkayın.
- HESC yıkanmış edilirken, MEF plakaları almak kuyulardan tüm medyayı çıkartın ve bir kez yıkayın steril, ılık 1 × PBS, pH 7.4 ES medya 2.5 ml (şimdi 10 ng / ml bFGF ile desteklenmiş) başına eklemek iyi.
- 10 ng bFGF ile desteklenmiş ES medya uygun bir hacim pelet hESC, tekrar (NOT:. HESC yeniden süspanse zaman, kabaca tekdüze koloni boyutu ve şekli olmalıdır tabanda hacmi bölme oranı bağlıdır) pipet hESC süspansiyon yukarı ve aşağı koloniler daha küçük ve daha düzgün yapmak için birkaç kez dikkatlice ama o kadar çok tek hücre ya da çok küçük koloniler üretilir. Her iyi bir son hacim olarak 3 ml ulaşmak için MEF plakaları hESC süspansiyon de ortalama 0,5 ml ekleyin. Görme hESC gecede yerleşmek için inkübatör plakaları yerleştirerek önce eşit olarak dağıtılmış olduğu emin olmak için kontrol edin. Kaplama sonra, genellikle karakteristik şekil ve sınır görünümünü almaya sömürgeler için bir kaç gün sürecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Kaplama öncesi son adım, hESC yeniden süspanse, kabaca tekdüze koloni boyutu ve şekli olmalıdır. HESC süspansiyon dikkatlice pipet ve bir kaç kez koloniler daha küçük ve daha düzgün yapmak için, ama o kadar çok tek hücre ya da çok küçük koloniler gibi Eki-hESC pluripotency belirteçleri, generated.Immunofluorescence boyama ve mikroskobu veya flow sitometri 4 ve SSEA-4, kültür sırasında farklılaşmamış bir devlet hESC bakım onaylamak için ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
