Summary
في هذا الفيديو ، وسوف نظهر لكم كيف يمكن تحليل السلسلة التنفسية الميتوكوندريا مجمعات بشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في المقايسات النشاط هلام.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات السيتوبلازمية التي لها دور أساسي في عملية الأيض الخلوية والتوازن ، وتنظيم شبكة الخلية إشارات ، وموت الخلايا المبرمج. الميتوكوندريا إنتاج ATP ، وتنظيم الدولة وحشوية الأكسدة CA2 ميزان + ، يقوض الأحماض الدهنية ، واصطناع الهيم ، النيوكليوتيدات ، وهرمونات الستيرويد ، والأحماض الأمينية ، وتساعد على تجميع الحديد والكبريت في مجموعات البروتينات. الميتوكوندريا أيضا أن يكون له دور أساسي في إنتاج الحرارة. الطفرات للجينوم الميتوكوندريا تسبب عدة أنواع من اضطراب الإنسان. تراكم الطفرات و mtDNA يرتبط مع الشيخوخة ، ويشتبه في أن لها دورا هاما في تطور السرطان. نظرا لدورها المهم جدا في جميع أنواع الخلايا ، يجب أن يكون وظيفة الميتوكوندريا أيضا أن تكون حاسمة للخلايا الجذعية. وقد تم إحراز تقدم رئيسي في فهمنا للبقاء الخلايا الجذعية ، والانتشار ، والقدرة على التمايز. ولكن النشاط الوظيفي للخلايا الجذعية ، وبخاصة الوضع الطاقة لديها ، لم يتم بعد دراستها بالتفصيل. ولا يعرف شيء تقريبا عن خصائص الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وذريتها السلائف متباينة. طريقة واحدة لفهم وتقييم دور في وظيفة الميتوكوندريا hESC والتنموية المحتملة لقياس مباشرة نشاط المجمعات التنفسي الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلية واللاحقة في التصور النشاط هلام كوسيلة لتحليل خمسة مجمعات سلسلة من hESCs الجهاز التنفسي.
Protocol
قرار واضح عالية Electophoresis جل الأصلية (hrCNE) لمجمع الميتوكوندريا فحوصات النشاط في جل
واستمرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أحادي الطبقة من ˠ - المشع أو mitomycin الليفية الماوس C - تعامل الجنينية (MEFs) ، ثم تحولت إلى النمو على Matrigel لمدة 5 أيام في المتوسط MEF مكيفة به الظروف القياسية. لإزالة تلوث MEFs ، تم إعادة hESCs مطلي على Matrigel ونمت في المتوسط MEF مكيفة ل3 أيام إضافية. تم استخدام المجهر المناعي للعلامات تعدد القدرات أكتوبر - 4 - 4 وSSEA لتأكيد عدم وجود تمايز hESC.
- غسل الخلايا مع 1X PBS الحارة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، تليها trypsinization (1ml من 1X التربسين لكل بئر في لوحة 6 أيضا) لمدة 5 دقائق.
- إضافة حجم مساو من التربسين المانع الطازج (1X 1mg/ml في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4). خلايا الحصاد وأجهزة الطرد المركزي في 200G ، 5 دقائق ، ودرجة حرارة الغرفة.
- تجاهل الخلايا وطاف في resuspend مكعبات 0.8 -- 1.7ml (استنادا إلى حجم الخلية بيليه) من الجليد الباردة عازلة عزل الميتوكوندريا (السكروز 83mM ؛ 6.6mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.0) مع الطازجة 1 'البروتياز كوكتيل المانع. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- Dounce الخلايا مع الخالط (~ 40-50 السكتات الدماغية). وصمة عار an قسامة من الخلايا dounced مع الأزرق التريبان للتحقق من اكتمال التجانس باستخدام مجهر الضوء.
- ز الطرد المركزي في 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الحصول على النفط الخام الميتوكوندريا بيليه الذي يحتوي أيضا نواة الخلية وشظايا أكبر. صب وتجاهل طاف وتزن عجلت الخام الميتوكوندريا بيليه. ويمكن تخزين بيليه في -80 درجة مئوية بعد تجميد لحظة في النيتروجين السائل ، إذا كانت هذه هي نقطة التوقف.
ملاحظة : يمكن استخدام الطرد المركزي التفاضلي أو غيرها من الإجراءات المستندة إلى التدرج من أجل عزل وجمع محض كسر غشاء الميتوكوندريا. انظر المرجع. 4 لمزيد من التفاصيل. وهذا النهج البديل العائد النشاط الميتوكوندريا المعقدة في ملغ من البروتين بدلا من الميتوكوندريا النشاط المعقدة في ملغ من وزن الخلية أو عدد الخلايا. وسوف تركز بروتينات الميتوكوندريا يجب أن يتم تحديد بعد تنقيتها لجعل هذه المقارنة. أيضا ، قد تكون هناك حاجة إلى العزلة عازلة مختلفة لهذا النهج. لsolubilization من الكسر غشاء الميتوكوندريا نقية ، انظر الملاحظة التالية الخطوة 6 أدناه. - Solubilize الخام الميتوكوندريا بيليه على الثلج بواسطة vortexing مع العازلة solubilization الجليد الباردة (50mM ، 50mM إيميدازول كلوريد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.0 ، 1MM EDTA ، 2mm و6 aminohexanoic حامض). يمكن استبدال حمض 6 aminohexanoic مع كوكتيل البروتياز المانع 1X. 35μl استخدام المخزن المؤقت في solubilization 20mg من وزن بيليه. إضافة 20μl 10 ٪ ث / ت ديجيتونين 20mg لكل من وزن بيليه ومزيج عبها بواسطة الأنبوب. لاحتضان 5-10 دقيقة على الجليد. يمكن أن تكون بديلا دوديسيل - BD - maltoside أو تريتون X - 100 لديجيتونين لsolubilize البروتينات. يجوز للاختيار من المنظفات وكميته تؤثر على تكوين أشكال أو supercomplexes multimeric المجمعات الميتوكوندريا. لمزيد من المعلومات ، انظر ref.1.
ملاحظة : كمية من المنظفات اللازمة لsolubilize محض كسر غشاء الميتوكوندريا يناظر نسبة الوزن المنظفات / البروتين تتراوح بين 6G - 2 / ز النسبة المثلى لsolubilize أغشية الميتوكوندريا هي 2.5G / ز لدوديسيل - BD - maltoside ، 3G / ز لتريتون X - 100 ، و6G / ز لديجيتونين. - أجهزة الطرد المركزي لبيليه في solubilized 100000 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف واضحة.
- إضافة إلى تحميل العازلة الجلسرين النهائي ث / ت 5 ٪ و 0.01 ٪ W / V الشقائقية S (استخدام 50 ٪ ث / ت الجلسرين ، و 0.1 ٪ وزن / حجم المخزون الاحتياطي الشقائقية S حل التحميل).
- تحميل الآبار هلام مع وحدة التخزين التي تحتوي على 20 - 40mg من بيليه الميتوكوندريا الخام في الممر. استخدام هلام تدرج الأكريلاميد (4 -13 ٪) مع 3.5 ٪ التراص هلام.
ملاحظة : إعداد جيل والشروط الكهربائي :
لتحضير هلام ، واستخدام مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (AA / bisAA) 3 المزيج على النحو التالي : 48G 1.5G من الأكريلاميد وbisacrylamide من (49.5 ٪ T ، 3 ٪ C. T أين هو التركيز الكلي لألف وbisAA و C النسبة المئوية للcrosslinker (bisAA) لمونومر المجموع).
هلام العازلة (3 ') : 6 - 1.5M aminohexanoic حمض ؛ إيميدازول 75mM ، ودرجة الحموضة 7.0
| التدرج الجل : | 4 ٪ | 13 ٪ | التراص الجل : | 3.5 ٪ |
| AA / 3 مزيج bisAA | 2 مل | 6.5 مل | 0.6 مل | |
| هلام العازلة 3 ' | 8.3 مل | 8.3 مل | 2.7 مل | |
| الغليسيرول | 5 ز | |||
| H 2 O | 14.7 مل | 5 مل | 4.7 مل | |
| اجمالى حجم | 25 مل | 25 مل | 8 مل | |
| 10 ٪ وكالة الأنباء الجزائرية | 139 ميكرولتر | 125 ميكرولتر | 67 ميكرولتر | |
| TEMED | 14 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر | 6.7 ميكرولتر |
الأنود العازلة : 25mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.0
العازلة الكاثود : Tricine 50mM ، 7.5mM إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، 0.02 ٪ W / V - BD - دوديسيل maltoside ، 0.05 ٪ W / V deoxycholate ، ودرجة الحموضة 7.0
صب وتشغيل المواد الهلامية في غرفة باردة (4-7 درجة مئوية). الجهد 100V الأولية المستخدمة. عندما دخلت عينة هلام التراص ، يتم رفع الجهد إلى 500V مع محدودة الحالية ل15mA (على 0.15 '14' 14 سم ، والمواد الهلامية). توقفت الكهربائي بعد ح 3-4 عند خط حاد في صبغ أحمر الشقائقية S نهج الجبهة هلام. بدلا من ذلك ، يمكن تشغيل هلام بين عشية وضحاها مع الجهد المستمر في 100V - 70.
- المقايسات النشاط في جل. وقت الحضانة لكل مقايسة يعتمد على كفاءة solubilization البروتين وكمية المواد المحملة لكل بئر. مجمعات الأول والرابع والخامس العائد عادة أقوى من اشارات المجمعات الثاني والثالث.
المجمع الأول (CI)
احتضان شريحة هلام مع العازلة CI (5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ؛ 0.1mg/ml NADH ؛ 2.5mg/ml NBT) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات.
CI العازلة : إضافة لكل من 100ML 5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 :
0.01g NADH
0.25g NBT
إصلاح هلام في الميثانول بنسبة 50 ٪ وحامض الخل بنسبة 10 ٪ عن 15-45 دقيقة. يحفظ الجل ثابتة في حامض الخليك 10 ٪.
المجمع الثاني (CII)
احتضان شريحة هلام مع العازلة CII (الصوديوم 20mM سكسينات ؛ 0.2mM methasulfate phenazine ؛ 2.5mg/ml NBT ؛ 5mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات.
CII العازلة : إضافة لكل من 100ML 5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 :
200μl سكسينات الصوديوم 1M
80μl methasulfate phenazine (PMS 250mM الذائبة في DMSO)
0.25g NBT
إصلاح هلام صفه للمجمع الأول
المجمع الثالث (CIII)
احتضان شريحة هلام مع العازلة CIII (50mM فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 0.05 ٪ 3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات.
CIII العازلة : إضافة الرقم الهيدروجيني في 100ML الصوديوم والفوسفات و50mM 7.2 :
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
إصلاح هلام صفه للمجمع الأول
المجمع الرابع (CIV)
احتضان شريحة هلام مع العازلة CIV (50mM فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 0.05 ٪ 3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ، 50μM الحصان القلب السيتوكروم ج) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات.
CIV العازلة : إضافة الرقم الهيدروجيني في 100ML الصوديوم والفوسفات و50mM 7.2 :
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
0.1g الحصان القلب السيتوكروم ج
إصلاح هلام صفه للمجمع الأول
المجمع الخامس (CV)
احتضان شريحة هلام العازلة مع السيرة الذاتية (35mM تريس القاعدة ، جليكاين 270mM ، ودرجة الحموضة 8.3 عند 25 درجة مئوية ، 14mM MgSO 4 ، 0.2 ٪ ث / ت الرصاص (NO 3) 2 ، 8MM ATP) في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات.
السيرة الذاتية العازلة : 100ML لكل من الحل إضافة :
| تريس القاعدة | 0.424g |
| جليكاين | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| PB (NO 3) 2 | 0.29g |
لا حاجة لتعديل درجة الحموضة (يجب أن تكون 8.3) -- عدم استخدام حمض أو قاعدة. وإضافة فلتر
| ATP | 0.441g |
إصلاح هلام في الميثانول بنسبة 50 ٪ لمدة 30 دقيقة ، ونقل إلى الماء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو ، ووصف لنا استخراج البروتين المجمعات الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والانفصال عن طريق قرار واضح عالية هلام إستشراد الأصلي (hrCNE) ، وتحليل لاحق من قبل في جل المقايسات نشاط الحفاز. hrCNE يحل مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا في قرار مشابه لذلك من اللون الأزرق هلام إستشراد المحلية ومتفوقة على المقايسات النشاط في جل. ويمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لتحديد الجهاز التنفسي الميتوكوندريا المجمعات الرابع ولكن أيضا لتحليل التركيبة المعقدة الوحيدات في أي غشاء الميتوكوندريا البروتين في كل وhESCs في ذريتها المشتقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معتمدة حاليا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 - 00313. نشكر الدكتور كارلا كولر (جامعة كاليفورنيا) وأعضاء المختبر كوهلر عن تقديم المشورة والرؤى في هذه الدراسات وإضافية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
