Summary
我们已经确定了在开发过程中作为一个主要的造血器官，胎盘。我们发现，造血干细胞（HSCs）都产生和扩大，在胎盘中的独特的微环境龛。在这里，我们描述了在小鼠胎盘中的造血干细胞的分离和可视化所需的实验技术。
Abstract
造血干细胞（HSCs）有能力自我更新，并生成整个一个人的一生血液谱系的所有类型的细胞。所有的造血干细胞出现在胚胎发育期间，后池的大小是保持自我更新的细胞分裂。已确定的造血干细胞和调节HSC的发展过程中的关键发育事件的解剖来源复杂，很多解剖部位参与在胎儿造血。最近，我们发现胎盘作为一个主要的造血器官的造血干细胞是生成和独特的微环境龛扩大（格卡斯，等2005年，罗德等2008）。因此，胎盘是造血干细胞在它们的出现和最初的扩张的重要来源。
在这篇文章中，我们解剖小鼠胎盘从E10.5和E12.5的胚胎，分别对应启动造血干细胞，并在胎盘的HSC的池的大小高峰期的发育阶段，隔离技术。此外，我们目前的胎盘组织中的酶和机械解离成单细胞停止使用流式细胞仪或功能分析的优化协议。我们已经发现，胎盘单细胞悬浮液胶原酶的使用提供了足够的造血干细胞的产量。从胎盘影响HSC的收益率的一个重要因素是机械分离的程度之前，和持续时间，酶处理。
我们还提供了编制固定冷冻胎盘组织切片的可视化开发造血干细胞免疫组织化学在其精确的细胞龛的协议。由于造血特异性抗原是不是保存在石蜡包埋切片做准备，我们经常使用固定的冰冻切片本地化胎盘造血干细胞和祖细胞。
Protocol
1。去除胚胎和胎盘夹层
- 首先，胚胎必须先隔离怀孕水坝。
- 动物安乐死按照批准的程序 - 在我们的例子中，我们将使用致死剂量的麻醉药异氟醚
- 首先，喷用乙醇腹部和一把剪刀做一个小切口。
- 用双手撕离皮肤，发现腹部切开腹膜。
- 用血管钳，拿起子宫角和收集他们用剪刀在每个末端。放置在培养皿用PBS置于冰上填补了子宫角。此外，请记住用PBS隔离胎盘前几次。现在，我们可以分离出胎盘。
- 随着两钳，开始仔细剥离了子宫内膜的胚胎conceptuses周围的组织。要小心不要穿刺或以其他方式造成的结构性破坏胚胎，因为这将随后清扫步骤复杂。
- 放置在一个新的培养皿用PBS冰盘上的隔离conceptuses和继续下去，直到所有conceptuses已经从子宫内膜释放。
- 传输conceptus到一个新的培养皿放置在显微镜下，用两个离胎盘剥离的蜕膜钳菜用PBS。删除尽可能多蜕膜，蜕膜细胞，会干扰单细胞悬液，流式细胞仪检测。一个平滑的连续剥离的议案，建议，以达到最佳效果。
- 切离卵黄囊胎盘在两个机构之间的交界处，轻轻一拉，从胎盘卵黄囊和卵黄船只靠近。应采取不破坏，特别是与早期胚胎的胎盘绒毛膜板。
- 仔细一对钳和脐带与另一胎盘的绒毛膜板，拉远离胎盘脐带和连接的胚胎。
- 删除多余的巨细胞组织在胎盘的边缘，以减少细胞聚集在单细胞悬液的制备。
- 收集在一个合适的容器，如15毫升猎鹰管，的胎盘，用PBS +5％胎牛血清和冰。所有解剖胎盘。
- 在这一点上，你可以进行准备一个单细胞悬液，流式细胞仪，功能分析，如在体外培养或移植，，或准备整个胎盘组织固定和固定的冻结块嵌入最终的免疫组织化学。
2。胎盘组织中的单细胞悬浮液的制备
- 现在，我们将告诉你如何从胎盘中产生的流式细胞仪分析单细胞悬浮液。
- 为了准备从胎盘的单细胞悬液，机械和酶解是必需的。首先准备在PBS中含10％FCS和1％青霉素/链霉素溶液0.1％胶原酶溶液。
- 胶原酶溶液中添加适当体积的胎盘，取决于你有多少。一个量的两倍胎盘量与25毫升建议。
- 使用16 G针装上的5毫升注射器，机械破坏，通过针3次传代胶原酶的解决方案和胎盘组织。重复18 - G针。
- 在37℃，5％CO2培养箱中放置45分钟的样品。
- 45分钟的孵育后胶原酶，通过20 G针通过电池解决方案，并培育一个额外的45分钟，在37 ° C。
- 1.5小时，通过22 - G和25 - G针胶原酶，通过细胞溶液的总孵化后的3倍，每针。
- 通过连接到一个新的15毫升猎鹰管的50微米过滤器过滤的样品，用PBS 5％胎牛血清和离心机在4℃在300℃× 5分钟G.
- 在这一点上，我们有一个合适的单细胞悬液，流式细胞仪分析或功能分析。
3。冰冻切片的组织固定
- 后立即隔离从每个胚胎的胎盘，它们被放置在冷1X PBS。通常一个96孔板工程最年轻胎盘（E8.5 - 11.5），但E12.5和老年人，年纪较大的胎盘，24孔板可能会更方便。
- 每个胎盘转移到刚刚解冻的4％paraformaldahyde或PFA，以及填补了一个新的。 E12.5胎盘组织转移到一个新的以及手工，但在E10.5，您可以删除的PBS仔细地用移液器和添加的煤灰。重要的是，胎盘完全浸泡2-4小时，在4 ° C，取决于组织的大小和年龄。
- 组织转移到30％的蔗糖，或如果该组织是非常小的和脆弱的，吸的煤灰和直接添加蔗糖。在这个阶段，胎盘将漂浮在溶液中。让组织停留在4℃过夜° C。
- 组织应在30％的蔗糖过夜一步后，最终沉到井底，表明适当的冷冻保存。一半的蔗糖溶液中取出，并更换与华侨城的数量和地方组织在4 ° C的1-2个小时。这有利于华侨城渗透。
- 组织转移至100％，华侨城，1小时后，它可以嵌入。
4。嵌入固定的组织
- 适当的组织鉴定（显示例如模具）标签的塑料模具。
- 将组织OCT的解决方案，并削减了一半的方向与圆盘形的胎盘和脐带朝下仔细之前释放压力，以确保一个干净的刀片一定要来回移动刀片切片胎盘一个连斩。胎盘是削减了一半，到后来的可视化胎盘造血干细胞，以达到最佳prientation。
- 在模具的底部放置一个与切边模具的底部表面接触的胎盘一半。重复与另一半的新模具。 E10.5胎盘，两半，可放置到相同的模具使用相同的技术。
- 华侨城入模浇筑时，它可以很难保持正确的方向胎盘。安全与组织半钳胎盘到位。慢慢地倒入模具华侨城的解决方案，避免产生任何气泡。 E10.5胎盘，由钳举行一个组织的一半和其他组织的一半靠在外面的镊子。慢慢倒入华侨城的解决方案，为E12.5胎盘。
- 一旦华侨城充满模具，快速模具放到干冰，华侨城将冻结的组织变为白色闪光
- 放入一个小塑料包，包含Drierite的模具，并立即储存在-80 ° C冰箱。
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Discussion
在本议定书中所描述的实验程序将允许胎盘组织造血干细胞和祖细胞的分离和可视化。对于预计在胎盘和其他胎儿造血器官的造血干细胞产量和胎儿发育的整个全面的总结，我们指的格卡斯，等。 2005年。对于发展中的造血干细胞和胎盘中的其他造血细胞的本地化，我们是指罗得岛等。 2008年。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mM Glucose | |||
| 10mM NaN3 | |||
| 15-ml conical tubes (BD) | |||
| 16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD) | |||
| 30% Sucrose Solution | |||
| 35mm Petri Dishes (BD) | |||
| 4% Paraformaldehyde | |||
| 50- m cell filters (Celltrics) | |||
| 5-ml syringes (BD) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector) | |||
| Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution | |||
| Collagenase type I (Sigma) | |||
| Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) | |||
| Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation) | |||
| Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55 | |||
| Drierite | |||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher) | |||
| Glucose Oxidase 1000u/ml | |||
| Levamisole (Vector) | |||
| Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ) | |||
| Normal Horse Serum (Vector) | |||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) | |||
| Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+) | |||
| Plastic Slide Box (holds 100 slides) | |||
| Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable) | |||
| Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) | |||
| Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) | |||
| Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher) | |||
| Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon) | |||
| Tween20, SigmaUltra (Sigma) | |||
| Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) | |||
| Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector) | |||
| Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) |
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
