Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Summary

Abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche durante lo sviluppo. Abbiamo trovato che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono entrambi generati e ampliato nella placenta in unica nicchie microambientali. Qui, descriviamo le tecniche sperimentali necessari per l'isolamento e la visualizzazione di cellule staminali nella placenta del mouse.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare tutti i tipi di cellule dei lignaggi di sangue per tutta la durata di un individuo. Tutte le CSE emergono durante lo sviluppo embrionale, dopo di che le loro dimensioni piscina è gestito da auto-rigenerante divisioni cellulari. Identificare l'origine anatomica di cellule staminali e gli eventi critici dello sviluppo che regolano il processo di sviluppo HSC è stato complicato come molti siti anatomici partecipare durante emopoiesi fetale. Recentemente, abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche dove si generano HSCs e ampliato nel unici nicchie microambientali (Gekas, et al 2005, Rodi, et al 2008). Di conseguenza, la placenta è una fonte importante di cellule staminali durante il loro nascita e l'espansione iniziale.

In questo articolo, mostriamo le tecniche di dissezione per l'isolamento di murino placenta da 10,5 e E12.5 embrioni, corrispondenti alle fasi di sviluppo di iniziazione di cellule staminali e il picco nella dimensione del pool di HSC nella placenta, rispettivamente. Inoltre, presentiamo un protocollo ottimizzato per dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto placentare in cella singola sospensione per l'uso in citometria a flusso o test funzionali. Abbiamo trovato che l'uso di collagenasi per cella singola sospensione della placenta dà rendimenti sufficiente di cellule staminali. Un fattore importante di rendimento HSC dalla placenta è il grado di dissociazione meccanica prima, e la durata di un trattamento enzimatico.

Forniamo anche un protocollo per la preparazione di fisso congelati sezioni di tessuto placentare per la visualizzazione di sviluppare HSCs mediante immunoistochimica nelle loro nicchie precise cellulare. Come ematopoietiche antigeni specifici non vengono mantenute durante la preparazione di sezioni in paraffina, si usano abitualmente fisso sezioni congelate per la localizzazione HSCs placentare e progenitori.

Protocol

1. Embrione rimozione e dissezione placentare

1. Per cominciare, gli embrioni devono essere prima isolati da dighe incinta.
2. Gli animali sono l'eutanasia secondo procedure approvate - nel nostro caso abbiamo intenzione di utilizzare una dose letale di anestetico isoflurano
3. In primo luogo, spruzzare il ventre con etanolo e fare una piccola incisione con un paio di forbici.
4. Strappare via la pelle con entrambe le mani per scoprire l'addome e tagliare aprire il peritoneo.
5. Con una pinza, raccogliere le corna uterine e alla loro raccolta con le forbici ad ogni estremità distale. Mettere le corna uterine in una capsula di Petri riempite con PBS e posto sul ghiaccio. Inoltre, ricordarsi di lavare più volte con PBS prima di isolare la placenta. Ora possiamo isolare la placenta.
6. Con due pinze, iniziare con attenzione peeling via il tessuto endometriale che circonda la conceptuses embrione. Si dovrebbe fare attenzione a non forare o comunque infliggere danni strutturali agli embrioni, in modo da complicare la dissezione passi successivi.
7. Posizionare il conceptuses isolato in un nuovo piatto di Petri con PBS su ghiaccio e continuare fino a quando tutti conceptuses sono stati liberati dalla endometrio.
8. Trasferire una concepito per un nuovo piatto di Petri con PBS posta sotto il microscopio e con due pinze sbucciare la decidua lontano dalla placenta. Rimuovere la maggior quantità di decidua il più possibile le cellule decidua interferirà con cella singola sospensione e citometria a flusso. Una fluidità del movimento continuo peeling è consigliata per ottenere i migliori risultati.
9. Tagliare il sacco vitellino lontano dalla placenta alla confluenza tra i due organi e tirare delicatamente il sacco vitellino ed i vasi vitellino lontano dalla placenta. Si deve prestare attenzione a non disturbare il piatto coriali della placenta, in particolare con embrioni precoci.
10. Con attenzione tenendo il piatto coriale della placenta con un paio di pinze e il cordone ombelicale con un altro, tirare il cordone ombelicale attaccato e embrione di distanza dalla placenta.
11. Rimuovere l'eccesso di tessuto a cellule giganti ai bordi della placenta al fine di minimizzare aggregazione delle cellule durante la preparazione della cella singola sospensione.
12. Raccogliere la placenta in un contenitore adeguato, come un tubo da 15 ml Falcon, con% FCS PBS +5 e sul ghiaccio. Fate questo per tutte le placente sezionato.
13. A questo punto, è possibile procedere con la preparazione di una cella singola sospensione per citometria a flusso, test funzionali, come la cultura in vitro o il trapianto, o preparare tutta la placenta per la fissazione dei tessuti e fissi blocco congelato embedding per immunoistochimica finale.

2. Preparazione di singole cellule sospensione del tessuto della placenta

1. Noi ora vi mostrano come generare una sospensione singola cellula da placenta per l'analisi FACS.
2. Per preparare una sospensione singola cellula da placenta, meccaniche e dissociazione enzimatica è richiesto. In primo luogo preparare una soluzione Collagenasi 0,1% in PBS con 10% FCS e 1% di soluzione di penicillina / streptomicina.
3. Aggiungere un volume appropriato di soluzione di collagenasi alla placenta, a seconda di quanti avete. Un volume che è il doppio del volume placenta e tra 2-5ml è raccomandato.
4. Utilizzare un ago 16-G montato su una siringa da 5 ml di distruggere meccanicamente i tessuti da passaging la soluzione di collagenasi e la placenta attraverso l'ago 3 volte. Ripetere con un 18-G ago.
5. Porre il campione a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 45 minuti.
6. Dopo l'incubazione 45 minuti a collagenasi, il passaggio alla soluzione delle cellule attraverso un ago 20-G, e incubare per altri 45 minuti, in 37 ° C.
7. Dopo l'incubazione 1,5 ore in totale collagenasi, il passaggio delle cellule attraverso la soluzione 22-25-G e G aghi 3 volte con ogni ago.
8. Filtrare il campione attraverso un filtro da 50 micron collegato a un nuovo tubo da 15 ml Falcon, lavare con PBS +5% FCS e centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a 300 × g.
9. A questo punto, abbiamo un'unica sospensione cellulare adeguata per l'analisi FACS o test funzionali.

3. Fissazione dei tessuti per le sezioni congelate

1. Immediatamente dopo aver isolato la placenta da ogni embrione, essi sono posti in freddo PBS 1X. Di solito una piastra a 96 pozzetti funziona meglio per placente giovani (E8.5-11.5), ma con i placente, E12.5 e più anziani, a 24 pozzetti può essere più conveniente.
2. Ogni placenta viene trasferito in un nuovo pozzo pieno di appena scongelati 4% paraformaldahyde o PFA. Per la E12.5 placenta, il tessuto è spostata in un nuovo pozzo a mano, ma per il 10,5 è possibile rimuovere il PBS con attenzione con una pipetta e aggiungere il PFA. E 'importante che la placenta è completamente immerso per 2-4 ore a 4 ° C, a seconda dell'età e delle dimensioni del tessuto.
3. Trasferire il tessuto in 30% di saccarosio, o se i tessuti sono molto piccoli e fragili, aspirare il PFA e aggiungere il saccarosio direttamente. In questa fase, la placenta sarà variabile a soluzione. Lasciate che i tessuti pernottamento a 4 ° C.
4. Dopo il passo durante la notte nel 30% di saccarosio, i tessuti dovrebbe in ultima analisi, si depositano sul fondo del pozzo, indicativo di crioconservazione corretta. Togliere la metà della soluzione di saccarosio e sostituire il volume con ottobre e il luogo del tessuto indietro nel 4 ° C per 1-2 ore. Questo facilita la penetrazione ottobre
5. Trasferire il tessuto al 100% ottobre per 1 ora, dopo di che può essere incorporato.

4. Incorporare il tessuto fissato

1. Stampi di plastica con l'etichetta di identificazione dei tessuti appropriati (ad esempio la muffa show).
2. Tirare fuori il tessuto della soluzione ottobre e tagliare a metà la placenta orientando la forma di disco placenta con il lato del cordone ombelicale rivolto verso il basso e con attenzione affettare con una lametta pulita avendo cura di spostare la lama avanti e indietro prima di rilasciare la pressione per assicurare un taglio uniforme. La placenta è tagliata a metà per ottenere il miglior prientation per visualizzare dopo il CSE placentare.
3. Mettere la metà placenta al fondo dello stampo con il bordo tagliato a contatto con la superficie inferiore dello stampo. Ripetete l'operazione con un nuovo stampo per l'altra metà. Per 10,5 placente, le due metà può essere messo nello stampo stesso utilizzando la stessa tecnica.
4. Quando si versa nello stampo ottobre, può essere difficile mantenere la placenta con l'orientamento corretto. Fissare la placenta in posizione tenendo la metà del tessuto con una pinza. Versare lentamente la soluzione ottobre nello stampo e di evitare di produrre le bolle. Per 10,5 placente, tenere la metà dei tessuti da pinze e il riposo l'altra metà dei tessuti contro l'esterno della pinza. Versare lentamente soluzione ottobre come descritto per E12.5 placente.
5. Una volta che lo stampo è riempito di ottobre, subito posto lo stampo su ghiaccio secco, l'ottobre si trasformerà flash bianco il congelamento dei tessuti
6. Mettere lo stampo in un sacchetto di plastica contenente Drierite e subito conservare in freezer -80 ° C.

Discussion

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo permetterà per l'isolamento e la visualizzazione del tessuto placentare e staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. Per un riepilogo completo di rendimento atteso su cellulare e numero di cellule staminali nella placenta fetale e di altri organi ematopoietici durante lo sviluppo fetale si fa riferimento a Gekas, et al. 2005. Per la localizzazione di cellule staminali e lo sviluppo di altre cellule ematopoietiche nella placenta si fa riferimento a Rodi, et al. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)