Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты

Summary

Мы определили, как плацента основных кроветворных органов в процессе разработки. Мы обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются как генерируется и расширен в плаценте в уникальных микроокружения ниши. Здесь мы опишем экспериментальные методы, необходимые для изоляции и визуализации в ГСК мыши плаценты.

Abstract

Гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) имеют возможность самостоятельно обновлять и создавать все типы клеток крови линий в течение всей жизни человека. Все ГСК возникают во время эмбрионального развития, после чего их размер пула поддерживается самообновлению клеточных делений. Определение анатомического происхождения ГСК и критического развития событий регулирующие процесс развития АПК было сложно, как много анатомических участвовать в период внутриутробного кроветворения. В последнее время мы выявили плаценты в качестве основной гемопоэтических орган, в котором ГСК генерируются и расширена в уникальной микроокружения ниши (Гекас, и др. 2005, Родос и др. 2008). Следовательно, плацента является важным источником ГСК во время их возникновения и начального развития.

В этой статье мы покажем рассечение методы для выделения мышиных плаценту от E10.5 и E12.5 эмбрионов, что соответствует стадии развития ГСК начала и пика в размере HSC бассейн в плаценту, соответственно. Кроме того, мы представляем оптимизированный протокол для ферментативной и механической диссоциации плацентарной ткани в одной клеточной суспензии для использования в проточной цитометрии или функционального анализа. Мы обнаружили, что использование коллагеназы для одно-клеточной суспензии плаценты дает достаточные выход ГСК. Важным фактором, влияющим на выход из HSC плацента степени механической диссоциации до, и продолжительность, ферментативную обработку.

Мы также предоставляем протокол для подготовки основных заморозки плацентарной ткани разделы для визуализации развития ГСК по иммуногистохимии в их точном сотовой ниши. Как гемопоэтические специфические антигены, не сохраняются в процессе приготовления парафиновых срезах, мы обычно используем фиксированный замороженных срезов для локализации плаценты ГСК и прародителей.

Protocol

1. Удаление эмбрионов и плаценты рассечение

1. Во-первых, эмбрионов сначала должен быть изолирован от беременной плотин.
2. Животных усыпляют в соответствии с утвержденными процедурами - в нашем случае мы будем использовать смертельную дозу анестетика изофлуран
3. Во-первых, распыление живота с этанолом и сделать небольшой разрез с ножницами.
4. Сорвите кожу с обеих рук, чтобы раскрыть живота и разрезать брюшины.
5. С щипцы, забрать рога матки и собирать их с помощью ножниц в каждом дистального конца. Место рогов матки в чашке Петри заполнены PBS и место на льду. Кроме того, не забывайте мыть несколько раз PBS до выделения плаценты. Теперь мы можем изолировать плаценты.
6. С двумя щипцов, начинают тщательно пилинг от эндометрия тканей, окружающих эмбрион оплодотворенные. Нужно быть осторожным, чтобы не прокалывать или иным образом нанести структурные повреждения эмбрионов, так как это осложнит последующие шаги рассечение.
7. Место изолированных оплодотворенные в новую чашку Петри с PBS на льду и продолжать, пока все оплодотворенные были освобождены от эндометрия.
8. Передача один зародыш в новую чашку Петри с PBS под микроскопом и с двумя щипцами кожуры децидуальной от плаценты. Удалить столько децидуальной насколько возможно, поскольку клетки децидуальной будет вмешиваться в одной клеточной суспензии и проточной цитометрии. Плавного непрерывного движения пилинг рекомендуется для достижения наилучших результатов.
9. Вырезать желточного мешка от плаценты на стыке двух органов и осторожно потяните желточного мешка и желточный суда от плаценты. Следует проявлять осторожность, чтобы не нарушать хорионического пластине плаценты, особенно с ранними эмбрионами.
10. Тщательно проведения хорионического пластине плаценты с одной парой щипцов и пуповины с другой, потяните пуповины и придает эмбриона от плаценты.
11. Удалите излишки ткани гигантские ячейки по краям плаценты с целью минимизации ячейки слипания в процессе приготовления одной клеточной суспензии.
12. Сбор плаценты в подходящую емкость, например, 15-мл трубки Falcon, с PBS +5% FCS и на льду. Сделайте это для всех плаценты расчленены.
13. На данный момент, вы можете приступить к подготовке одноклеточные суспензии для проточной цитометрии, функциональные тесты, такие, как в пробирке культуру или трансплантации, или подготовить целый плаценты для фиксации тканей и фиксированных замороженных блоков вложения для возможной иммуногистохимии.

2. Подготовка одной клеточной суспензии ткани плаценты

1. Теперь мы покажем вам, как создать единую суспензии клеток из плаценты для анализа FACS.
2. Для подготовки суспензии отдельных клеток из плаценты, механической и ферментативной диссоциации не требуется. Первый подготовить 0,1% коллагеназы решение в PBS с 10% FCS и 1% пенициллина / стрептомицина решение.
3. Добавить соответствующий объем коллагеназы решение плаценты, в зависимости от того, сколько у вас есть. Том, который в два раза объем плаценты, а также между 2-5 мл рекомендуется.
4. Использование 16-G иглы установлены на 5-мл шприц, чтобы механически нарушить ткани пассажи решение коллагеназы и плаценты через иглу в 3 раза. Повторите с 18-G иглы.
5. Образец закрепляется в 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора в течение 45 минут.
6. После 45 минут инкубации в коллагеназы, прохождения ячейки раствор через 20-G иглу, и выдержать в течение еще 45 минут, в 37 ° C.
7. После 1,5 часа инкубации в общем коллагеназы, прохождения ячейки раствор через 22-G и 25-G иглы 3 раза с каждой иглы.
8. Фильтры образца через 50-мкм фильтр придает новый 15-мл трубки Falcon, промыть PBS +5% FCS и центрифуги при 4 ° С в течение 5 минут при 300 × g.
9. На данный момент, у нас есть один суспензии клеток подходит для анализа FACS или функционального анализа.

3. Фиксация ткани для замороженных срезов

1. Сразу после выделения плаценты от каждого эмбриона, они помещаются в холодную 1X PBS. Обычно 96-луночного планшета работает лучше всего для молодых плаценты (E8.5-11.5), но со взрослыми плаценты, E12.5 и старше, 24-луночного планшета может быть более удобным.
2. Каждый плаценты переносится в новой скважины заполнены свежей талой 4% paraformaldahyde или PFA. Для E12.5 плаценты, ткани переехал в новое и вручную, но для E10.5 можно удалить PBS тщательно с пипеткой и добавить PFA. Важно, что плацента полностью погружают на 2-4 часа при температуре 4 ° С, в зависимости от возраста и размера ткани.
3. Передача ткани в 30% сахарозы, или если ткани очень маленькая и хрупкая, аспирация PFA и добавляют сахарозу напрямую. На данном этапе, плацента будет плавающий в растворе. Пусть тканей остаться на ночь при 4 ° C.
4. После ночи шагом в 30% сахарозы, ткани должны в конечном итоге оседают на дно колодца, что свидетельствует о надлежащей криоконсервации. Удаление половины раствором сахарозы и заменить объеме с октября и место ткани еще в 4 ° С в течение 1-2 часов. Это облегчает проникновение октября.
5. Передача ткани до 100% октябре в течение 1 часа, после чего он может быть встроен.

4. Вложение Исправлена ​​тканей

1. Этикетка пластиковые формы с соответствующей идентификации ткани (плесень показать пример).
2. Потяните ткань из раствора октября и сократить плаценты в два раза, ориентируя в форме диска плаценты с пуповиной стороны вниз и тщательно нарезки с чистым лезвием и обязательно двигаться лезвие вперед и назад перед выпуском давления с целью обеспечения даже сократить. Плацента разрезать пополам, чтобы достичь наилучших prientation позже визуализировать плацентарной ГСК.
3. Положите одну плаценту половине в нижней части формы с отреза в контакте с нижней поверхности пресс-формы. Повторите с новой пресс-формы для другой половины. Для E10.5 плаценты, обе половины может быть помещен в ту же форму, используя тот же метод.
4. Когда заливка октября в пресс-форму, это может быть трудно держать плаценты в правильной ориентации. Безопасные плаценты на месте, удерживая ткань пополам с щипцами. Медленно влить октября решение в форму и избежать производящих любой пузыри. Для E10.5 плаценты, провести одну половину ткани щипцы и отдыха вторую половину ткани с внешней щипцами. Медленно влить октября решение, как описано для E12.5 плаценты.
5. Как только форма заполняется октября, быстро месте плесень на сухой лед, октябрь станет белая вспышка замораживания тканей
6. Место плесень в небольшой пластиковый пакет с Drierite и сразу же магазин в -80 ° C морозильнике.

Discussion

Экспериментальных процедур, описанных в данном протоколе позволит изоляции и визуализации плацентарной ткани и кроветворных стволовых и прогениторных клеток. Для всеобъемлющее резюме на ожидаемых сотовых выход и количество ГСК в плаценте и других эмбриональных кроветворных органов протяжении внутриутробного развития мы называем Гекас, и др.. 2005 год. Для локализации развивающихся ГСК и другие гемопоэтические клетки в плаценте мы ссылаемся на Родос, и соавт. 2008 год.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)