Summary
العدلات هي من بين الخلايا الأولى للوصول في موقع رد الفعل المناعي للالتهابات ، وخضعت للدراسة وظائفها وآليات على نطاق واسع في المختبر. نظهر متدرجة الكثافة الطريقة المعيارية الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام وسائل الإعلام فصل متاحة تجاريا.
Abstract
المحببة النوى العدلة (PMN) هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر وبين الخلايا الأولى للوصول في موقع رد الفعل المناعي للالتهابات. نظرا لدورها الرئيسي في الالتهاب ، وتدرس على نطاق واسع وظائف العدلات مثل الحركة والإنتاج خلوى ، البلعمة ، ومكافحة الأورام الخلية. لتوصيف وظائف محددة من العدلات ، وهي طريقة نظيفة وسريعة وموثوقة للفصل بينها وبين غيرها من خلايا الدم غير المرغوب فيه في الدراسات المختبرية ، وخصوصا العدلات قصيرة الأمد ويجب استخدامها خلال 2-4 ساعات من جمعها. هنا ، علينا أن نظهر متدرجة الكثافة الطريقة المعيارية الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الانفصال التي هي مزيج من الصوديوم وmetrizoate ديكستران 500. الإجراء يتكون من طبقات الدم كله على مدى الانحدار متوسطة الكثافة ، الطرد المركزي ، والفصل بين طبقة العدلة ، وتحلل من الكريات الحمراء المتبقية. ثم يتم غسل الخلايا ، وعدها ، ومعلق في المخزن الى التركيز المطلوب. عندما يقوم بشكل صحيح ، وقد تبين هذا الأسلوب لعينات من محصول> العدلات 95 ٪ مع بقاء> 95 ٪.
Protocol
العدلة عزل بروتوكول
- جمع كل الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
- جمع 5.0 مل من وسائل الإعلام في عزلة العدلة أنبوب الطرد المركزي. مل بعناية 5.0 طبقة من الدم على وسائل الإعلام الانفصال. تنفيذ هذه الخطوة ببطء وبعناية ، ومع طرف ماصة على مقربة من سطح وسائل الإعلام إلى تجنب الاختلاط الدم ووسائل الإعلام.
- الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي ل500 35 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. ينبغي للفصل الدم إلى 6 فرق متميزة : البلازما ، وحيدات ، ووسائل الإعلام العزلة ، والعدلات ، وسائل الاعلام مزيدا من العزلة ، وخلايا الدم الحمراء بيليه (الشكل 1). إذا كانت هذه العصابات ليست واضحة ، كانت عملية الفصل ليست نظيفة وستكون هناك حاجة لتكرارها.
- إزالة بعناية أكبر ثلاث طبقات (البلازما ، وحيدات ، ووسائل الإعلام العزلة) باستخدام ماصة. التخلص من هذه الطبقات.
- ماصة بعناية طبقة من العدلات وجميع وسائل الإعلام عزلة تحت العدلات. وضع الحل في أنبوب الطرد المركزي نظيفة.
- تمييع الحل العدلة إلى 10 مل مع HBSS دون كا 2 + / + 2 ملغ. عكس الأنبوب عدة مرات لوقف الخلايا.
- الحل العدلة الطرد المركزي في 350 RCF لمدة 10 دقائق. وينبغي أن يكون حاضرا بيليه حمراء في أسفل الأنبوب ، وتحتوي على العدلات المتبقية خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). إزالة طاف مع ماصة بعناية بحيث لا بالانزعاج بيليه.
- لكرات الدم الحمراء وليز المتبقية ، إضافة 2 مل تحلل الخلايا الحمراء العازلة للأنبوب. لresuspend ، وبيليه دوامة القارورة في وضع 3-4. تجنب زيادة الإعداد دوامة 4 أعلاه ، لأن هذا قد يؤدي إلى تفعيل العدلات. قد يكون من الضروري دوامة لعدة ثوان ، أو إلى "نبض" الدوامة حل لبيليه.
- أنبوب الطرد المركزي في 250 RCF لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع ماصة. كرر العملية lysing إذا لزم الأمر.
- إضافة 500 HBSS ميكرولتر دون كا 2 + / + 2 ملغ لكل أنبوب. مرة أخرى ، إلى دوامة resuspend الكرية في وضع 3-4. مخفف الى 10 مل مع HBSS دون كا 2 + / + 2 ملغ.
- أنابيب الطرد المركزي في 250 RCF لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف تجاهل.
- Resuspend وبيليه في 250 HBSS ميكرولتر / الحل HSA (2 ٪ HSA). ثم الخلايا قد تحسب وتعديلها لتركيز المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم استخدام أسلوب التدرج كثافة الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام مزيج من الصوديوم وmetrizoate ديكستران 500. ويستند هذا الأسلوب على طريقة فصل الكريات البيضاء وحيدة النواة التي Boyum (1968) الذي تم تعديله من قبل لفصل العدلة فيرانتي وثونغ (1980).
بعد جمعها من المانحين ، قد يكون anticoagulated الدم الكامل مع EDTA ، سيترات ، أو الهيبارين. نظرا لأنها لم تدم طويلا ، يجب استخدام العدلات ضمن 2-4 ساعات من جمعها. الإجراء يتكون من طبقات الدم كله على مدى الانحدار متوسطة الكثافة ، الطرد المركزي ، والفصل بين طبقة العدلة ، وتحلل من الكريات الحمراء المتبقية. ثم يتم غسل الخلايا ، وعدها ، ومعلق على التركيز المطلوب.
إذا الفرق الستة هي لا تختلف بعد خطوة الطرد المركزي الأول ، لم تكن عملية الانفصال النظيف وسوف تحتاج إلى أن يتكرر. لفصل نظيفة ، وتأكد من أن وسائل الإعلام لم تنته العزلة أو ملوثة. قد تكون أيضا فصل ناجحة إذا المتبرعين بالدم قد استهلك الكحول أو الأدوية في الساعات ال 72 السابقة لجمع الدم.
لمنع تفعيل العدلات أثناء إجراء الانفصال ، فمن الأفضل استخدام HBSS دون CA2 + / + Mg2 ، وقد ثبت منذ الأيونات إلى خلايا الوزراء. وينبغي أيضا إعادة تعليق من الكريات يتم تنفيذ ببطء ، ويجب أن تبقى في دوامة إعدادات تنشيط المنخفضة إلى منتصف نطاق الخلايا بحيث لا يصبح.
عندما يقوم بشكل صحيح ، وقد تبين هذا الأسلوب لعينات من محصول> العدلات 95 ٪ مع بقاء> 95 ٪. ويمكن تقييم الجدوى التي النقاء ووصفها مع الخلايا العدلة CD66b علامة معينة واستبعاد التريبان صبغة زرقاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة HL56621 R01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
