Summary
Les neutrophiles sont parmi les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire, et de leurs fonctions et mécanismes ont été largement étudiés in vitro. Nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant des milieux de séparation disponibles commercialement.
Abstract
Neutrophiles polynucléaires neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants chez les humains et chez les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire. En raison de leur rôle clé dans l'inflammation, les fonctions des neutrophiles tels que la locomotion, la production de cytokines, la phagocytose, et lutter contre des cellules tumorales sont largement étudiés. Afin de caractériser les fonctions spécifiques des neutrophiles, une méthode propre, rapide, fiable et de les séparer des autres cellules sanguines est souhaitable pour des études in vitro, en particulier depuis les neutrophiles sont de courte durée et doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. Ici, nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total à l'aide des médias disponibles dans le commerce de séparation qui est un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et resuspendues dans un tampon à la concentration voulue. Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de> 95% des neutrophiles avec la viabilité> 95%.
Protocol
Isolement des neutrophiles Protocole
- Amener tous les réactifs à température ambiante.
- Collecter 5,0 ml de milieux d'isolement des neutrophiles dans le tube de la centrifugeuse. Soigneusement couche de 5,0 ml de sang sur les médias de séparation. Effectuez cette étape lentement et soigneusement, et avec la pointe de la pipette à proximité de la surface du média pour éviter de mélanger le sang et les médias.
- Centrifuger à 500 RCF pendant 35 min à 20-25 ° C. Le sang doit se séparer en 6 bandes distinctes: le plasma, les monocytes, les milieux d'isolement, les neutrophiles, des milieux d'isolement de plus, et les globules rouges culot (figure 1). Si ces bandes ne sont pas claires, le processus de séparation n'était pas propre et aura besoin d'être répété.
- Retirer délicatement les trois couches supérieures (plasma, des monocytes et des milieux d'isolement) en utilisant une pipette. Eliminer ces couches.
- Soigneusement pipette la couche de neutrophiles et de l'ensemble des milieux d'isolement sous les neutrophiles. Placer la solution dans un tube à centrifuger propre.
- Diluer la solution des neutrophiles à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +. Inverser le tube à quelques reprises de suspendre les cellules.
- Centrifuger la solution des neutrophiles à 350 RCF pendant 10 minutes. Une pastille rouge doit être présent au fond du tube, contenant des neutrophiles et des résidus de globules rouges (hématies). Enlever le surnageant avec une pipette avec soin afin que le culot n'est pas perturbé.
- Pour lyser les globules rouges résiduels, ajouter 2 ml de tampon de lyse des érythrocytes au tube. Pour resuspendre le culot, vortex le flacon à un réglage de 3-4. Évitez d'augmenter le réglage de vortex au-dessus de 4, car cela pourrait provoquer des neutrophiles pour l'activer. Il peut être nécessaire de vortex pendant quelques secondes, ou de «pouls» du vortex pour dissoudre le culot.
- Centrifuger le tube à 250 RCF pendant 5 min. Enlever le surnageant avec une pipette. Répétez le processus de lyse, si nécessaire.
- Ajouter 500 ul de HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 + dans chaque tube. Encore une fois, vortex pour remettre le culot à un réglage de 3-4. Diluer à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +.
- Centrifuger les tubes à 250 RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et le jeter.
- Reprendre le culot dans 250 ul de HBSS / Solution HSA (2% HSA). Les cellules peuvent ensuite être comptés et ajusté à la concentration voulue.
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Discussion
La méthode de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. Cette méthode est basée sur la méthode de séparation des leucocytes mononucléaires par Boyum (1968) qui a été modifiée pour la séparation des neutrophiles par Ferrante et Thong (1980).
Après la collecte d'un donneur, du sang entier anticoagulé peut être avec de l'EDTA, du citrate ou héparine. Comme ils sont de courte durée, les neutrophiles doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et remises en suspension à la concentration voulue.
Si les six bandes ne sont pas distinctes après la première phase de centrifugation, le processus de séparation n'était pas propre et aura besoin d'être répété. Pour la séparation propre, assurez-vous que les médias l'isolement n'est pas expirée ou contaminée. La séparation peut également être infructueuse si les donneurs de sang a consommé de l'alcool ou des médicaments dans les 72 heures précédant la collecte de sang.
Pour empêcher l'activation des neutrophiles au cours de la procédure de séparation, il est préférable d'utiliser HBSS sans Ca2 + / Mg2 +, car les ions a été démontré que les cellules préférentiel. Remise en suspension de granules devrait également être effectuée lentement, et les paramètres de vortex doivent être conservés dans le bas-milieu de gamme afin que les cellules ne deviennent pas activé.
Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de> 95% des neutrophiles avec la viabilité> 95%. Pureté et la viabilité peut être évaluée par marquage des cellules avec des neutrophiles marqueur spécifique CD66b et l'exclusion du colorant bleu trypan.
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Acknowledgments
Le financement du NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
