Summary
Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen, und ihre Funktionen und Mechanismen wurden ausführlich in vitro untersucht. Wir zeigen eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennmedien isolieren.
Abstract
Neutrophile polymorphkernige Granulozyten (PMN) sind die häufigsten Leukozyten bei Menschen und unter den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei Entzündungen sind neutrophile Funktionen wie Fortbewegung, die Produktion von Zytokinen, Phagozytose und Tumorzellen zu bekämpfen intensiv untersucht. Zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen der neutrophilen Granulozyten, ist eine saubere, schnelle und zuverlässige Methode zur Trennung von anderen Blutzellen wünschenswert, in-vitro-Studien, zumal Neutrophilen kurzlebig sind und sollte innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Hier zeigen wir eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennung Medien, die eine Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 ist zu isolieren. Das Verfahren besteht aus Schichten Vollblut über den Dichtegradienten-Medium, Zentrifugation, Trennung von neutrophilen Schicht und Lyse der restlichen Erythrozyten. Die Zellen werden dann gewaschen, gezählt und in Puffer resuspendiert, um gewünschte Konzentration. Wenn richtig ausgeführt, hat diese Methode wurde gezeigt, dass Proben von> 95% Neutrophile mit> 95% Lebensfähigkeit zu erhalten.
Protocol
Neutrophile Isolation Protocol
- Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur.
- Sammeln Sie 5,0 ml der neutrophilen Isolation Medien in Zentrifugenröhrchen. Sorgfältig Schicht 5,0 ml Blut über die Trennung Medien. Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig, und mit der Pipettenspitze dicht an der Oberfläche der Medien zur Vermeidung der Vermischung des Blutes und der Medien.
- Zentrifuge bei 500 RCF für 35 min bei 20-25 ° C. Das Blut sollte trennen in 6 verschiedenen Bands: Plasma, Monozyten, Isolation Medien, Neutrophilen, mehr Isolation Medien, und die roten Blutkörperchen Pellet (Abbildung 1). Wenn diese Bänder nicht klar sind, war die Trennung Prozess nicht sauber und muss wiederholt werden.
- Entfernen Sie vorsichtig die oberen drei Schichten (Plasma, Monozyten und Isolation Medien) mit Hilfe einer Pipette. Entsorgen Sie diese Schichten.
- Sorgfältig Pipette die Schicht von Neutrophilen und alle die Isolierung Medien unter der Neutrophilen. Legen Sie die Lösung in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
- Verdünnen Sie die Neutrophilen-Lösung auf 10 ml mit HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 +. Drehen Sie die Röhre ein paar Mal, um die Zellen zu suspendieren.
- Zentrifugieren Sie die Neutrophilen-Lösung bei 350 RCF für 10 Minuten. Ein rotes Pellet sollte am unteren Ende der Röhre vorhanden ist, mit Neutrophilen und Rest-roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig, so dass die Pellets nicht gestört wird.
- Um lysieren die restlichen Erythrozyten, 2 ml Red Cell Lysis Buffer, um das Rohr. Um das Pellet, Wirbel der Flasche bei einer Einstellung von 3-4. Erhöhen Sie die Vortex-Einstellung über 4, da dies kann dazu führen, die Neutrophilen zu aktivieren. Es kann notwendig sein, Wirbel für einige Sekunden oder "Puls" der Wirbel um das Pellet zu lösen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 RCF für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit Pipette. Wiederholen Sie die Lyse-Prozess, falls erforderlich.
- Add 500 ul HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 + in jedes Röhrchen. Wieder Wirbel um das Pellet bei einer Einstellung von 3-4 resuspendieren. Verdünnen auf 10 ml mit HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 +.
- Zentrifugieren bei 250 RCF für 5 min. Den Überstand aspirieren und verwerfen.
- Das Pellet in 250 ul HBSS / HSA-Lösung (2% HSA). Zellen können dann gezählt und angepasst werden, um gewünschte Konzentration.
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Discussion
Der Dichtegradient Trennverfahren wird verwendet, um menschliche Neutrophile aus Vollblut mit einer Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 zu isolieren. Diese Methode basiert auf den mononukleären Leukozyten Trennverfahren durch Boyum (1968), die für die Neutrophilen Trennung von Ferrante und Thong (1980) wurde modifiziert, basiert.
Nach der Entnahme aus einem Spender, kann Vollblut mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert werden. Da sie kurzlebig sind, sollten Neutrophilen innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Das Verfahren besteht aus Schichten Vollblut über den Dichtegradienten-Medium, Zentrifugation, Trennung von neutrophilen Schicht und Lyse der restlichen Erythrozyten. Die Zellen werden dann gewaschen, gezählt und erneut auf die gewünschte Konzentration.
Wenn die sechs Bands nicht unterscheidbar sind nach dem ersten Zentrifugationsschritt wurde das Trennverfahren nicht sauber und muss wiederholt werden. Für saubere Trennung, stellen Sie sicher, dass die Isolierung Medien noch nicht abgelaufen ist oder verseucht. Die Trennung kann auch nicht erfolgreich sein, wenn der Blutspender hat Alkohol oder Medikamente in den 72 Stunden vor der Blutentnahme konsumiert.
Um zu verhindern, Neutrophilenaktivierung während der Trennung Verfahrens ist es am besten, HBSS ohne Ca2 verwenden + / Mg2 +, da die Ionen in den Prime-Zellen gezeigt worden. Resuspension des Pellets sollten auch langsam ausgeführt werden, und Vortex-Einstellungen sollten im niedrigen bis mittleren Bereich, so dass Zellen nicht aktiviert werden aufbewahrt werden.
Wenn richtig ausgeführt, hat diese Methode wurde gezeigt, dass Proben von> 95% Neutrophile mit> 95% Lebensfähigkeit zu erhalten. Reinheit und Lebensfähigkeit durch Kennzeichnung der Zellen mit Neutrophilen-spezifischen Marker CD66b und Trypanblau Ausschluß beurteilt werden.
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Acknowledgments
Die Finanzierung von NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
