Summary
Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.
Abstract
Neutrófilos granulócitos polimorfonucleares (PMN) são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória. Devido ao seu papel fundamental na inflamação, as funções de neutrófilos, como locomoção, produção de citocinas, fagocitose e combate de células tumorais são amplamente estudados. Para caracterizar as funções específicas de neutrófilos, um método limpo, rápido e confiável de separá-los de outras células sanguíneas é desejável para os estudos in vitro, especialmente desde que os neutrófilos têm vida curta e deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. Aqui, nós demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando a mídia separação comercialmente disponível que é uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspenso em tampão de concentração desejada. Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%.
Protocol
Isolamento de neutrófilos Protocolo
- Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente.
- Coletar 5,0 ml de meios de isolamento de neutrófilos no tubo de centrifugação. Cuidadosamente camada de 5,0 ml de sangue sobre a mídia separação. Realizar esta etapa lenta e cuidadosamente, e com a ponta da pipeta perto da superfície da mídia para evitar a mistura do sangue e da mídia.
- Centrifugar a 500 RCF por 35 min a 20-25 ° C. O sangue deve separar em 6 bandas distintas: plasma, monócitos, meios de isolamento, neutrófilos, media mais de isolamento, e os glóbulos vermelhos pellet (Figura 1). Se essas bandas não são claras, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido.
- Remova cuidadosamente os três camadas (plasma, monócitos e meios de isolamento), utilizando uma pipeta. Elimine essas camadas.
- Pipeta com cuidado a camada de neutrófilos e de todos os meios de isolamento sob o neutrófilos. Coloque a solução em um tubo de ensaio limpo.
- Diluir a solução de neutrófilos para 10 ml com HBSS sem + / Mg 2 + Ca 2. Inverter o tubo várias vezes para suspender as células.
- Centrifugar a solução de neutrófilos em 350 RCF por 10 minutos. A pelota vermelha deve estar presente no fundo do tubo, contendo neutrófilos e residual glóbulos vermelhos (hemácias). Remover o sobrenadante com uma pipeta com cuidado para que a pelota não é perturbado.
- Para lisar as hemácias residual, adicionar 2 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo. Para ressuspender o sedimento, vortex do frasco com um ajuste de 3-4. Evitar o aumento da configuração vórtice acima de 4, já que isso pode causar o neutrófilos para ativar. Pode ser necessário vortex por alguns segundos, ou a "pulso" do vórtice para dissolver o sedimento.
- Centrifugar o tubo a 250 rcf durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita o processo de lise, se necessário.
- Adicionar 500 mL HBSS sem Ca 2 + / Mg 2 + para cada tubo. Mais uma vez, vórtice para ressuspender o sedimento em uma configuração de 3-4. Diluir para 10 ml com HBSS sem + / Mg 2 + Ca 2.
- Centrifugar os tubos a 250 rcf durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e descartar.
- Ressuspender o sedimento em 250 mL HBSS / Solução HSA (2% HSA). Células podem então ser contados e ajustados a concentração desejada.
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Discussion
A densidade método de separação de gradiente é usado para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. Este método é baseado no método de separação de leucócitos mononucleares por Boyum (1968) que foi modificado para a separação de neutrófilos por Ferrante e Thong (1980).
Após a coleta de um doador, o sangue total pode ser anticoagulados com EDTA, citrato ou heparina. Uma vez que eles são de curta duração, os neutrófilos deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspendidas a concentração desejada.
Se as seis bandas não são distintos após a primeira etapa de centrifugação, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido. Para a separação limpa, certifique-se que a meios de isolamento não tenha expirado ou contaminados. Separação também pode ser vencida se o doador de sangue tem consumido álcool ou medicamentos nas 72 horas anteriores à coleta de sangue.
Para evitar a ativação de neutrófilos durante o processo de separação, o melhor é usar HBSS sem Ca2 + / Mg2 +, uma vez que os íons têm sido mostrados para células prime. Ressuspensão de pellets também deve ser realizada lentamente, e as configurações de vórtices deve ser mantido na baixa a mid-range para que as células não são ativadas.
Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%. Pureza e viabilidade pode ser avaliada pela rotulagem as células com neutrófilos específicos marcador CD66b e exclusão de corante azul de tripano.
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Acknowledgments
Financiamento do NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
