Summary
וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.
Abstract
אנו משתמשים כל תא מהדק טכניקה טלאי ללמוד את המעגלים הסינפטי שבבסיס עיבוד המידע החזותי ברשתית. בסרטון הזה, אנו נדריך אותך בתהליך של ביצוע כל תא הקלטות של זרמים מעוררים אור של תאים בודדים בהכנת פרוסה הרשתית. אנו משתמשים נמר מימיים כמו סלמנדרה במודל חיה. נתחיל בתיאור דיסקציה של העין ולהראות כמה פרוסות מורכבים עבור הקלטות אלקטרו. לאחר פרוסה ממוקמת בחדר ההקלטה, אנו מדגימים כיצד לבצע כל תא מהדק הקלטות מתח. לאחר מכן, אנו הפרויקט גירויים חזותיים על photoreceptors של הפרוסה לעורר אור עורר תגובות הנוכחי. במהלך ההקלטה אנו perfuse את הפרוסה עם סוכני תרופתי, לפיה מערכת ערוץ 8-זלוף מאפשר לנו לעבור במהירות בין סוכנים שונים. הכנה פרוסה רשתית נעשה שימוש נרחב הרשתית עבור הקלטות מהדק תיקון, בפרט ללמוד amacrine או תאים דו קוטבית, אשר אינם נגישים בהכנת כל הר.
Protocol
פתרונות
- פתרון תאיים בתאי הגנגליון (מ"מ): 100-K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH
- פתרון תאיים עבור תאים דו קוטבית (מ"מ): 90 K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH
- רינגר תאיים של פתרון (מ"מ): 112 NaCl, גלוקוז 5, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, מותאם pH = 7.75 עם NaOH. חמצון של הפתרון אינו הכרחי.
הכן חדרי הקלטה
חדר הקלטה שלנו מורכבת של המיקרוסקופ שקופית עם דבק גם בו בלוקים סיליקון קטן לגזור דבק אחר גם ממוקמים לספק יציבות עבור פרוסות הרקמה.
הכנת פרוסות רשתית
כדי למנוע הלבנת של קולטני האור, החיתוך מתבצע באור אינפרא אדום או אור אדום עמום. אם מישהו מעוניין הקלטה ותגובות מסלול מוט, רק אור IR יש להשתמש (IR לנתח מיקרוסקופ ואין אור בחדר. נוספות משקפי IR יש להשתמש הליכים לא נעשה תחת המיקרוסקופ). אם מישהו מתעניין בעיקר הקלטה אור חרוט התגובות, חדר אפלולי אור אדום או אור אדום פלאש יכול לשמש. מיקרוסקופ עם זאת, עדיין צריך להיות oculars IR.
אם קלט photoreceptor אינה רלוונטית לצורך הניסוי, ההליכים יכולים להתבצע באור חדר רגיל באמצעות מיקרוסקופ רגיל.
- הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופ עם סיליקון דבק טוב: ליצור שתי רצועות מקבילות של גריז סיליקון (כ 0.5 ס"מ זה מזה) בכל שקופית ומקום חתיכה מלבנית של נייר סינון בצד אחד של השקופית, המעבר הן להקות שומן (לדחוף את המסנן נייר חלק סכין גילוח, כך הוא מחובר היטב לשקופית)
- הקורבן סלמנדרה על פי פרוטוקולים הקמה: החיה ממוקם באמבט קרח במשך 30 דקות, הכרות אז פעמיים דקורה.
- הסרת עין מהראש סלמנדרה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח על פיסת נייר טבולה פתרון קר כקרח רינגר
- הסרה של רקמת חיבור מהעין
- השתמש סכין גילוח לעשות חתך קטן בקרנית
- החזק חתך בקרנית עם מלקחיים תוך הסרת אותו במספריים לאורך מצורף שלה לעין
- מוציאים את העדשה עם מלקחיים
- החזק את אירוס עם מלקחיים חתך לאורך serrata אורה להסיר את הקשתית
- חותכים את עיינית לשני חלקים מלבניים
- להרים את אחד החלקים ולמקם אותו בצד sclera על נייר המסנן (לוודא לשטח את היצירה בעודה דוחפת אותו בזהירות רבה)
- בעדינות להרים את sclera את הרשתית, אשר כעת אמור להיות מצורף הנייר filer
- להוסיף במהירות פתרון קר כקרח רינגר אל הבאר
- חזור זהה עבור פיסת השני
- השתמש סכין גילוח להציב מבצעה בהתאמה אישית לקצץ 200-300μm פרוסות רחב.
- השתמש זוג מלקחיים להרים את פרוסות בצד של נייר הסינון, להפוך אותם על כך את השכבות של הרשתית להיות גלוי, ומניחים אותם על להקות גריז ואקום
- בחרו פרוסה שנראית ניזוק ומראה להקות אופקי המציין את השכבות של הרשתית (השכבות הם לפעמים קשה לראות מתחת למיקרוסקופ לנתיחה כמו ההגדלה אינו גבוה מספיק, אולם אם אפשר לזהות כמה שכבות פרוסה הוא בדרך כלל מספיק טוב. ההחלטה הסופית בשאלה אם להשתמש פרוסה עם זאת, הוא עשה פעם אחת הוא מוצג תחת מיקרוסקופ זקוף). הזז אותו כדי להחליק את תא הקלטת על ידי בניית גשר Ringer בין שתי שקופיות
- ודא שהנייר לסנן נדחף כנגד קוביות גומי בחדר הקלטה כך פרוסה אינו מוטה (תאים הגנגליון ו photoreceptors צריך להיות בפוקוס באותו זמן)
הצבת את הרקמה במתקן ההקלטה
- שקופית ההקלטה ממוקם מתחת למיקרוסקופ ואת perfused עם פתרונות של רינגר דרך syste זלוף הכבידה
- ההכנה היא דמיינו עם מיקרוסקופ זקוף עם מטרה 10x ו 40X טבילה במים.
- שוב, אנו רק להשתמש באור אינפרא אדום כדי למנוע הלבנת של photoreceptors. מצלמת IR מחובר ליציאה הצדדית של המיקרוסקופ, אשר מחובר למסך טלוויזיה.
גירוי חזותי
גירויים חזותיים מתוכנתים ב-Matlab באמצעות Psychtoolbox הם מוקרנת על רשתית העין באמצעות יציאת העליון של המיקרוסקופ באמצעות תמונה מיקרוסקופית ההזרקה (Mbf במדעי החיים). Bits + + מעבד וידאו דיגיטלי (Cambridge Research Systems) משמש כדי לקבל קנה מידה בהיקות 14bit ו synchronize מצגת גירוי עם רכישת נתונים. גירויים חזותיים המשמשים זה וידאו ברים בהירות או כהות (רוחב = 460μm) של 100% לעומת זאת, שהוצגו במשך שתי שניות על רקע אחיד קבוע (בהיקות = 8 * 10 4 פוטונים / מיקרומטר / s, גודל: 1.84 x 1.38mm).
Electrophysiology
- אלקטרודות תיקון המגיעים בורוסיליקט זכוכית (OD:.. מזהה 1.5mm, 84mm) עם חולץ micropipette. עבור תאים הגנגליון, התנגדויות הם בין 2 ל 4 MOhms. עבור תאים דו קוטבית, התנגדות גבוהה יותר בין 4 ל 8 MOhms משמשים.
- הקלטות קלאמפ מתח מבוצעות באמצעות 700A Multiclamp (התקנים מולקולריים), מגבר ותוכנה מעבדה פנימי מתוכנת LabVIEW.
- סמים הם perfused דרך מערכת ערוץ 8-זלוף. אלקטרודה microperfusion ממוקם קרוב הפרוסה (רקמת צריך לעבור לעין כאשר אתה מסובב את זלוף לסירוגין, אבל צריך להיות זהירים כי הלחץ אינו חזק מדי, כך פרוסה יכולה להיות מנותקת נייר הסינון). במהלך הניסויים microperfusion צריך להיות מופעל כל הזמן (פתרון בקרת המרוססת אם אין סמים יש צורך), כך ההקלטה אינה מקבלת מופרע על ידי החלפת זלוף לסירוגין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יתרונות:
- כל סוגי תאים נגישים
- זיהוי קל של סוגי תאים, בפרט אם פלורסנט לצבוע מתווסף פתרון האלקטרודה
- סוכני תרופתי יכול בקלות להגיע תאים היעד
- הטכניקה מהדק התיקון מאפשר לחקור את התפקיד של תעלות יונים שונים חישובים הרשתית. מידע אותו לא ניתן להשיג באמצעות הקלטות extracelluar ספייק או הקלטות עם אלקטרודות חדה.
- טכניקה זו ניתן ליישם מודלים של בעלי חיים אחרים
חסרונות:
- תהליכים עשוי לקבל לנתק בתהליך של חיתוך. לכן, מחקרים המתמקדים בתחום פתוח מרחבי עלול להיות קשה.
- כמו ברשתית ביותר בהכנות חוץ גופית המשמשת electrophysiology, אפיתל הפיגמנט מוסר, מה שעלול להוביל להלבנה של photoreceptors. מחקרים הדורשים גירוי עם עוצמות אור גבוהות או צורך ללמוד את הרשתית לפי מדינות הסתגלות רבים עלול להיתקל בקשיים עם טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
