Summary
यह वीडियो जलीय बाघ समन्दर की रेटिना टुकड़ा में पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया से पता चलता है. हम टुकड़ा के रूप में कैसे रेटिना के दृश्य उत्तेजना के दौरान प्रदर्शन करने के लिए पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में अच्छी तरह से तैयारी प्रदर्शित करता है.
Abstract
हम पूरे सेल पैच दबाना तकनीक का उपयोग करने के लिए synaptic circuitry रेटिना में है कि underlies दृश्य सूचना संसाधन अध्ययन. इस वीडियो में, हम आपको रेटिना टुकड़ा तैयारी में प्रकाश पैदा व्यक्ति की कोशिकाओं की धाराओं के पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की प्रक्रिया के माध्यम से मार्गदर्शन करेगा. हम एक पशु मॉडल के रूप में जलीय बाघ समन्दर का उपयोग करें. हम आंख के विच्छेदन का वर्णन से शुरू करते हैं और शो कैसे स्लाइस electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए बढ़ रहे हैं. एक बार टुकड़ा रिकार्डिंग कक्ष में रखा गया है, हम प्रदर्शन कैसे पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए. हम तो टुकड़ा में photoreceptors पर दृश्य stimuli करने के लिए प्रकाश पैदा वर्तमान प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना परियोजना. रिकॉर्डिंग के दौरान हम औषधीय एजेंटों के साथ टुकड़ा perfuse, जिससे एक 8 - चैनल प्रणाली छिड़काव हमें जल्दी से अलग एजेंटों के बीच स्विच करने के लिए अनुमति देता है. रेटिना टुकड़ा तैयारी रेटिना में व्यापक रूप से है पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया, विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए amacrine या द्विध्रुवी कोशिकाओं, जो माउंट पूरी तैयारी में सुलभ नहीं हैं.
Protocol
समाधान
- Intracellular समाधान के लिए नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (मिमी): 100 कश्मीर gluconate, KCl 8, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 एटीपी, 0.5 GTP, 90 सुक्ष्ममापी Sulforhodamine बी (धुंधला) के लिए, = के साथ 7.4 पीएच को समायोजित KOH
- द्विध्रुवी कोशिकाओं (मिमी में) के लिए intracellular समाधान: 90 कश्मीर gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 एटीपी 0.5 GTP, 90 सुक्ष्ममापी Sulforhodamine बी (धुंधला) के लिए, = के साथ 7.4 पीएच को समायोजित KOH
- कोशिकी है घंटी समाधान (मिमी): 112 NaCl, ग्लूकोज 5, 5 HEPES, 2 KCl, 2 2 CaCl, 1 2 MgCl NaOH के साथ 7.75 = पीएच के लिए समायोजित . समाधान की oxygenation आवश्यक नहीं है.
रिकॉर्डिंग कक्षों तैयार
हमारे रिकॉर्डिंग कक्ष चिपकने वाला एक अच्छी तरह से जो छोटे सिलिकॉन अन्य चिपकने के बाहर काट ब्लॉक अच्छी तरह से ऊतक स्लाइस के लिए स्थिरता प्रदान करने के लिए रखा जाता है के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड के होते हैं.
रेटिना स्लाइस की तैयारी
Photoreceptors के विरंजन से बचने के लिए, विच्छेदन बाहर आईआर या मंद लाल बत्ती की रोशनी में किया जाता है. यदि एक छड़ी मार्ग से प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड में रुचि है, केवल IR प्रकाश (आईआर खुर्दबीन और कोई जगह नहीं प्रकाश विदारक अतिरिक्त आईआर चश्मे खुर्दबीन के नीचे नहीं किया प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.) इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि एक मुख्य रूप से शंकु प्रकाश प्रतिक्रियाओं, मंद लाल कमरे की बत्ती या एक लाल फ्लैश लाइट रिकॉर्डिंग में रुचि रखते है इस्तेमाल किया जा सकता है. माइक्रोस्कोप, तथापि, अभी भी आईआर oculars होना चाहिए.
यदि फोटोरिसेप्टर इनपुट के प्रयोग के लिए अप्रासंगिक है, प्रक्रियाओं को सामान्य कमरे प्रकाश में बाहर किया जा सकता है एक नियमित रूप से माइक्रोस्कोप का उपयोग.
- चिपकने वाला एक सिलिकॉन के साथ दो खुर्दबीन स्लाइड को अच्छी तरह से तैयार: सिलिकॉन तेल के दो समानांतर (बारे में 0.5 सेमी के अलावा) के प्रत्येक स्लाइड पर बैंड बनाने और स्लाइड के एक तरफ फिल्टर पेपर के एक आयताकार टुकड़ा जगह है, दोनों तेल बैंड पार (फिल्टर धक्का एक धार के भाग के साथ कागज इतना है कि यह अच्छी तरह से स्लाइड करने के लिए जुड़ा हुआ है)
- जानवर 30 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान में रखा जाता है, तो decapitated और डबल pithed: स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार एक समन्दर बलिदान.
- समन्दर सिर से नजर निकालें और टिशू पेपर के एक टुकड़े पर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह जगह बहुत ठंडा है घंटी के समाधान के साथ सिक्त
- आँख से संयोजी ऊतक निकालें
- धार का प्रयोग करने के लिए कॉर्निया में एक छोटे से काट कर
- संदंश के साथ कॉर्निया में कटौती जबकि यह कैंची से हटाने के अपने लगाव के साथ आंख के लिए पकड़ो
- संदंश के साथ लेंस निकालें
- संदंश के साथ परितारिका पकड़ो और ora serrata साथ कटौती करने के लिए परितारिका हटायें
- दो आयताकार टुकड़ों में eyecup कट
- एक टुकड़े की उठाओ और आईटी श्वेतपटल पक्ष फिल्टर पेपर पर जगह (के लिए बाहर टुकड़ा समतल है, जबकि यह धक्का नीचे बहुत ध्यान से करना सुनिश्चित करें)
- धीरे रेटिना बंद श्वेतपटल लिफ्ट, जो अब filer कागज करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए
- जल्दी अच्छी तरह से ठंडा घंटी समाधान जोड़ने
- दूसरा टुकड़ा के लिए एक ही दोहराएँ
- एक उस्तरा एक कस्टम बनाया slicer 200 300μm विस्तृत स्लाइस में कटौती में रखा ब्लेड का उपयोग करें.
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए फिल्टर पेपर के पक्ष में स्लाइस लेने, उन्हें बारी से अधिक तो रेटिना की परतों के दिखाई देने लगते हैं, और उन्हें जगह वैक्यूम तेल बैंड पर
- एक टुकड़ा है कि undamaged लग रहा है और क्षैतिज बैंड रेटिना की परतों (परतें कभी कभी विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए कठिन के रूप में बढ़ाई पर्याप्त उच्च नहीं है, लेकिन अगर एक कुछ layering पहचान कर सकते हैं टुकड़ा आम तौर पर काफी अच्छा संकेत दिखाता है उठाओ. चाहे टुकड़ा का उपयोग करने के लिए पर अंतिम निर्णय है, तथापि, एक बार यह ईमानदार खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है) किया जाता है. रिकॉर्डिंग चैम्बर स्लाइड के लिए यह दो स्लाइड्स के बीच एक घंटी पुल का निर्माण करके ले जाएँ
- सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर रिकार्डिंग कक्ष में रबर ब्लॉकों के खिलाफ धक्का दिया है, इतना है कि टुकड़ा झुका नहीं है (नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और photoreceptors ध्यान में एक ही समय में होना चाहिए)
रिकॉर्डिंग रिग में ऊतक रखकर
- रिकॉर्डिंग स्लाइड खुर्दबीन के नीचे रखा जाता है और गुरुत्वाकर्षण छिड़काव syste के माध्यम से घंटी समाधान के साथ perfused
- तैयारी एक 10x और 40x पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना है.
- फिर, हम केवल IR प्रकाश का उपयोग करने के लिए photoreceptors के विरंजन रोकने के. एक IR कैमरा माइक्रोस्कोप के पक्ष बंदरगाह है, जो एक टीवी स्क्रीन करने के लिए जुड़ा हुआ है जुड़ा हुआ है.
दृश्य उत्तेजना
दृश्य उत्तेजनाओं Psychtoolbox का उपयोग Matlab में क्रमादेशित रहे हैं और एक माइक्रोस्कोपी छवि इंजेक्टर (MBF bioscience) का उपयोग कर खुर्दबीन के शीर्ष बंदरगाह के माध्यम से रेटिना पर पेश है. एक बिट्स + + डिजिटल वीडियो प्रोसेसर (कैंब्रिज रिसर्च सिस्टम्स) के लिए एक 14bit luminance पैमाने प्राप्त है और synchr के लिए प्रयोग किया जाता हैडाटा अधिग्रहण के साथ प्रोत्साहन प्रस्तुति onize. इस वीडियो में इस्तेमाल किया दृश्य उत्तेजनाओं 100% इसके विपरीत के उज्ज्वल या काले सलाखों (460μm चौड़ाई =), जो दो सेकंड के लिए एक स्थिर वर्दी (पृष्ठभूमि पर प्रस्तुत किए गए हैं luminance = 10 * 4 / फोटॉनों / सुक्ष्ममापी, आकार 8: 1.84 x 1.38mm).
इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी
- एक micropipette खींचने के साथ: पैच इलेक्ट्रोड borosilicate ग्लास (1.5mm आईडी, 84mm ओवर ड्राफ्ट) से खींच रहे हैं. नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए resistances 2 और 4 MOhms के बीच हैं. द्विध्रुवी कोशिकाओं के लिए, 4 और 8 MOhms के बीच उच्च resistances किया जाता है.
- वोल्ट क्लैंप रिकॉर्डिंग एक Multiclamp (आण्विक उपकरण) 700A, एम्पलीफायर और प्रयोगशाला आंतरिक Labview में क्रमादेशित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.
- ड्रग्स एक 8 - चैनल प्रणाली छिड़काव के माध्यम से perfused कर रहे हैं. microperfusion इलेक्ट्रोड बंद टुकड़ा (ऊतक दिख ले जाने चाहिए, जब आप छिड़काव पर और बंद है, लेकिन एक की जरूरत है सावधान रहना है कि दबाव भी मजबूत ताकि टुकड़ा फिल्टर पेपर से अलग हो सकता नहीं है) के लिए रखा गया है. प्रयोगों के दौरान microperfusion लगातार चालू किया जाना चाहिए (perfusing नियंत्रण समाधान यदि कोई दवाओं की जरूरत है) इतना है कि रिकॉर्डिंग पर छिड़काव स्विचन और बंद करके परेशान नहीं करता है.
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Discussion
लाभ:
- सभी प्रकार की कोशिकाओं सुलभ हैं
- सेल प्रकार की आसान पहचान, विशेष रूप से अगर एक फ्लोरोसेंट रंजक इलेक्ट्रोड समाधान के लिए जोड़ा जाता है
- औषधीय एजेंटों को आसानी से लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुँच सकते हैं
- पैच दबाना तकनीक रेटिना संगणना में अलग आयन चैनल की भूमिका की जांच करने के लिए अनुमति देता है. एक ही जानकारी extracelluar कील तेज इलेक्ट्रोड के साथ रिकॉर्डिंग या रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है.
- इस तकनीक को अन्य पशु मॉडल को लागू किया जा सकता है
नुकसान:
- प्रक्रियाओं टुकड़ा करने की क्रिया की प्रक्रिया में काट सकता है. इसलिए, अध्ययन है कि स्थानिक ग्रहणशील क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित मुश्किल हो सकता है.
- सबसे इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल की तैयारी में रेटिना में के रूप में, वर्णक उपकला हटा दिया है, जो photoreceptors के विरंजन नेतृत्व कर सकते हैं. अध्ययन है कि उच्च प्रकाश तीव्रता के साथ उत्तेजना की आवश्यकता होती है या कई अनुकूलन राज्यों के तहत रेटिना अध्ययन की जरूरत है इस तकनीक के साथ कठिनाइयों में चला सकता है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
