Summary
Este vídeo muestra el proceso de células enteras grabaciones pinza de voltaje en la porción de retina de la salamandra tigre acuático. Se demuestra la preparación de la corte, así como la forma de realizar grabaciones de patch clamp durante la estimulación visual de la retina.
Abstract
Utilizamos la técnica de patch clamp de célula entera para estudiar los circuitos sinápticos que subyace en el procesamiento de información visual en la retina. En este vídeo, le guía a través del proceso de desarrollo de células enteras grabaciones de la luz corrientes evocadas de células individuales en la preparación rebanada de la retina. Usamos el medio ambiente acuático salamandra tigre como un modelo animal. Comenzamos con la descripción de la disección de los ojos y mostrar cómo se montan las rebanadas de registros electrofisiológicos. Una vez que el corte se coloca en la cámara de grabación, que muestran cómo realizar grabaciones de células enteras de fijación de voltaje. A continuación, los proyectos de estímulos visuales en los fotorreceptores en el corte de luz para obtener respuestas evocadas actual. Durante la grabación que perfundir en el sector con agentes farmacológicos, por un sistema de perfusión de 8 canales que nos permite cambiar rápidamente entre los diferentes agentes. La preparación rebanada de retina es ampliamente utilizado para las grabaciones de patch clamp en la retina, en particular para estudiar amacrinas o células bipolares, que no son accesibles en una preparación de todo el montaje.
Protocol
Soluciones
- Solución intracelular de las células ganglionares (en mM): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH
- Solución intracelular de las células bipolares (en mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH
- Ringer extracelular de solución (en mM): 112 NaCl, 5 de glucosa, HEPES 5, 2 KCl, CaCl2 2, 1 MgCl 2, ajustada a pH = 7,75 con NaOH. La oxigenación de la solución, no es necesario.
Prepare las cámaras de grabación
Nuestra cámara de registro consiste en un portaobjetos de microscopio con un adhesivo y en el que pequeños bloques de silicona cortada de otro adhesivo y se colocan para dar estabilidad a las secciones de tejidos.
Preparación de rodajas de retina
Para evitar la decoloración de los fotorreceptores, la disección se lleva a cabo a la luz tenue luz infrarroja o roja. Si uno está interesado en registrar las respuestas de la vía de la barra, sólo la luz infrarroja se debe utilizar (IR microscopio de disección y sin luz de la habitación. Adicionales gafas de IR se debe utilizar para los procedimientos no se realiza bajo el microscopio). Si uno está interesado principalmente en el registro de respuesta de los conos de luz, con poca luz ambiente de color rojo o una linterna de color rojo se puede utilizar. El microscopio, sin embargo, todavía debe tener oculares IR.
Si la entrada de los fotorreceptores es irrelevante para el experimento, los procedimientos pueden llevarse a cabo a la luz normal de la habitación utilizando un microscopio normal.
- Prepare dos portaobjetos con un adhesivo de silicona, así: crear dos bandas paralelas de grasa de silicona (alrededor de 0,5 cm de distancia) en cada diapositiva y colocar un trozo rectangular de papel de filtro en un lado de la diapositiva, cruzando las dos bandas de grasa (empuje el filtro papel con parte de una hoja de afeitar para que se agarra bien a la diapositiva)
- Sacrificio de una salamandra de acuerdo a los protocolos establecidos: el animal se coloca en un baño de hielo durante 30 minutos, y luego decapitado y doble pithed.
- Eliminar los ojos de la cabeza de salamandra y lo coloca bajo la lupa en un pañuelo de papel humedecido con una solución helada de Ringer
- Eliminar el tejido conjuntivo del ojo
- Use una hoja de afeitar para hacer una pequeña incisión en la córnea
- Mantenga cortar la córnea con una pinza mientras se retira con unas tijeras a lo largo de su adhesión a los ojos
- Retire el objetivo con fórceps
- Sostenga el iris con una pinza y corte a lo largo de la ora serrata para eliminar el iris
- Cortar el ocular en dos piezas rectangulares
- Recoger una de las piezas y el lugar que parte esclerótica hasta en el papel de filtro (asegúrate de que para aplanar la pieza, mientras que empuja hacia abajo con mucho cuidado)
- Con cuidado, levante la esclerótica en la retina, que ahora deberá adjuntarse al documento de servidor de archivos
- Añadir rápidamente una solución helada de Ringer para el bienestar
- Repita lo mismo con la segunda pieza
- Use una hoja de afeitar colocado en una máquina de cortar por encargo de cortar 200-300μm rebanadas de ancho.
- Use un par de pinzas para recoger las rebanadas en el lado del papel de filtro, darles la vuelta para las capas de la retina se hacen visibles, y colocarlos en las bandas de grasa de vacío
- Escoja un sector que se ve en buen estado y muestra las bandas horizontales que indican las capas de la retina (las capas son a veces difíciles de ver bajo el microscopio de disección como la ampliación no es suficiente, sin embargo, si se puede reconocer algunas capas de la rebanada es generalmente suficiente. La decisión final sobre si se debe usar el corte, sin embargo, se hace una vez que se observa bajo el microscopio en posición vertical). Mover a la cámara de registro de diapositivas mediante la construcción de un puente de timbre entre las dos diapositivas
- Asegúrese de que el papel de filtro es empujado contra los bloques de caucho en la cámara de grabación, por lo que el sector no está inclinado (células ganglionares y los fotorreceptores se debe enfocar en, al mismo tiempo)
Colocar el tejido en el equipo de grabación
- La diapositiva de grabación se coloca bajo el microscopio y perfundidos con Ringer a través de una perfusión syste gravedad
- La preparación se visualiza con un microscopio vertical, con un objetivo de inmersión en agua 10x y 40x.
- Una vez más, sólo usamos luz infrarroja para prevenir la decoloración de los fotorreceptores. Una cámara de infrarrojos se conecta al puerto lateral del microscopio, que está conectado a una pantalla de televisión.
La estimulación visual
Los estímulos visuales son programadas en Matlab utilizando el Psychtoolbox y se proyectan en la retina a través del puerto de la parte superior del microscopio utilizando una imagen de microscopía de inyector (MBF biociencias). A Bits + + procesador de vídeo digital (Cambridge Research Systems) se utiliza para obtener una escala de luminosidad de 14 bits y Synchronize la presentación del estímulo a la adquisición de datos. Los estímulos visuales que se utilizan en este video son las barras brillantes u oscuros (width = 460μm) del 100% de contraste, que se presentaron durante dos segundos sobre un fondo uniforme, constante (luminancia = 8 * 10 4 fotones / m / s, tamaño: 1,84 x 1.38mm).
Electrofisiología
- Electrodos de parche se tira de vidrio de borosilicato (OD:.. Identificación de 1,5 mm, 84 mm) con un extractor de micropipeta. De las células ganglionares, las resistencias se sitúan entre 2 y 4 MOhms. De las células bipolares, el aumento de las resistencias entre 4 y 8 MOhms se utilizan.
- Grabaciones de pinza de voltaje se realizan con un 700A MultiClamp (Molecular Devices), un amplificador y software de laboratorio interno programado en Labview.
- Las drogas son perfundidos a través de un sistema de perfusión de 8 canales. El electrodo microperfusión se coloca cerca de la corte (el tejido visiblemente debe moverse cuando se enciende la perfusión dentro y fuera, pero hay que tener cuidado de que la presión no es demasiado fuerte para que el sector podría desprenderse del papel de filtro). Durante los experimentos microperfusión debe estar constantemente encendido (solución de control de la perfusión de drogas si no son necesarios) para que la grabación no se inquiete por el cambio de la perfusión de encendido y apagado.
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Discussion
Beneficios:
- Todos los tipos de células son accesibles
- Fácil identificación de los tipos de células, en particular si un tinte fluorescente se añade a la solución de electrodos
- Agentes farmacológicos pueden llegar fácilmente a las células diana
- La técnica de patch clamp permite investigar el papel de los diferentes canales iónicos en los cálculos de la retina. La misma información no se puede obtener a través de grabaciones extracelulares pico o grabaciones con electrodos afilados.
- Esta técnica se puede aplicar a otros modelos animales
Desventajas:
- Procesos puede ser que consiga cortar en el proceso de corte. Por lo tanto, los estudios que se centran en el campo receptivo espacial puede ser difícil.
- Como en la mayoría de la retina en preparaciones in vitro utilizados para la electrofisiología, el epitelio pigmentario es eliminado, lo que puede conducir a la decoloración de los fotorreceptores. Los estudios que requieren la estimulación con altas intensidades de luz o la necesidad de estudiar la retina en los estados de adaptación que muchos podrían encontrar dificultades con esta técnica.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
