Summary
Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.
Abstract
We gebruiken de whole-cell patch clamp techniek om de synaptische circuits die ten grondslag ligt visuele informatieverwerking in het netvlies te bestuderen. In deze video, zullen wij begeleiden u door het proces van het uitvoeren van whole-cell-opnamen van het licht opgeroepen stromingen van de individuele cellen in het netvlies slice voorbereiding. We gebruiken de in het water levende tijger salamander als een diermodel. We beginnen met een beschrijving van de dissectie van het oog en laten zien hoe schijfjes zijn gemonteerd voor elektrofysiologische opnames. Zodra het schijfje is geplaatst in de opname kamer, we laten zien hoe je whole-cell voltage clamp opnames uit te voeren. Vervolgens hebben we het project visuele prikkels op de fotoreceptoren in de slice aan het licht opgewekte stroom reacties uitlokken. Tijdens de opname hebben we perfuseren het segment met farmacologische stoffen, waarbij een 8-kanaals perfusie-systeem stelt ons in staat om snel te schakelen tussen verschillende agenten. Het netvlies slice voorbereiding wordt veel gebruikt voor patch clamp opnames in het netvlies, met name om amacrine of bipolaire cellen, die niet toegankelijk zijn in een geheel-mount voorbereiding van studie.
Protocol
Oplossingen
- Intracellulaire oplossing voor het ganglion cellen (in mm): 100 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH
- Intracellulaire oplossing voor bipolaire cellen (in mm): 90 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH
- Extracellulaire Ringer-oplossing (in mm): 112 NaCl, 5 Glucose, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl2, een MgCl 2, op pH = 7,75 met NaOH. Oxygenatie van de oplossing is niet nodig.
Bereid de opname kamers
Onze opnamestudio kamer bestaat uit een objectglaasje met een lijm goed waarbij zowel kleine siliconen blokken uit een andere lijm gesneden worden geplaatst om de stabiliteit van het weefsel plakjes te bieden.
De voorbereiding van het netvlies plakken
Om te voorkomen dat bleken van de fotoreceptoren, is de dissectie uitgevoerd in IR of zwak rood licht licht. Indien men geïnteresseerd is in het opnemen van reacties van de staaf weg, mag alleen infrarood licht gebruikt worden (IR dissectiemicroscoop en geen ruimte licht. Extra IR-bril moet worden gebruikt voor de procedures niet gedaan onder de microscoop). Als men vooral geïnteresseerd in het opnemen van kegel licht de reacties, afm rode kamer licht of een rood flitslicht kunnen worden gebruikt. De microscoop moet echter nog wel IR lenzen.
Als fotoreceptor ingang is niet relevant voor het experiment, kunnen procedures worden uitgevoerd in een normale kamer licht met behulp van een gewone microscoop.
- Bereid twee microscoopglaasjes met een zelfklevende siliconen goed: maak twee parallelle banden van siliconenvet (ongeveer 0,5 cm uit elkaar) op elke dia en plaats een rechthoekig stuk filtreerpapier aan de ene kant van de glijbaan, kruising zowel vet banden (druk op de filter papier met een deel van een scheermes, zodat het goed is bevestigd aan de dia)
- Offer een salamander volgens vastgestelde protocollen: het dier is geplaatst in een ijsbad gedurende 30 minuten, daarna onthoofd en dubbel-pithed.
- Verwijder de ogen van salamander hoofd en plaats het onder de microscoop ontleden op een stukje tissue bevochtigd met de oplossing ijskoude Ringer's
- Verwijderen bindweefsel van het oog
- Gebruik scheermesje om een klein sneetje te maken in het hoornvlies
- Houd gesneden hoornvlies met een pincet, terwijl het verwijderen met een schaar langs de gehechtheid aan het oog
- Haal de lens met een tang
- Houd de iris met een tang en knip langs de ora serrata om de iris te verwijderen
- Snijd de oogschelp in twee rechthoekige stukken
- Pick-up een van de stukken en leg deze sclera kant naar boven op het filter papier (zorg ervoor dat afvlakken het stuk terwijl u naar beneden heel voorzichtig)
- Til de sclera uit het netvlies, die nu moet worden gehecht aan de filer papier
- Voeg snel ijskoude Ringer-oplossing voor het goed
- Herhaal hetzelfde voor het tweede stuk
- Gebruik een scheermesje geplaatst in een op maat gemaakte snijmachine 200-300μm breed plakjes snijden.
- Gebruik een tang op te halen de plakken aan de zijkant van het filter papier, draai ze om, zodat de lagen van het netvlies zichtbaar worden, en leg ze op de stofzuiger vet bands
- Kies een plakje dat ziet er onbeschadigd en toont horizontale banden met vermelding van de lagen van het netvlies (de lagen zijn soms moeilijk te zien onder de microscoop dissectie als de vergroting is niet hoog genoeg is, maar als men kan begrijpen dat sommige lagen van de slice meestal goed genoeg. De uiteindelijke beslissing over de vraag of de slice te gebruiken, echter, is gemaakt zodra het wordt bekeken onder de microscoop rechtop). Verplaats het naar de opname kamer dia door het bouwen van een Ringer brug tussen de twee dia's
- Zorg ervoor dat het filter papier wordt gedrukt tegen de rubberen blokken in de opname kamer, zodat het schijfje is niet gekanteld (ganglion cellen en fotoreceptoren moeten in focus zijn op hetzelfde moment)
Het plaatsen van het weefsel in de opname rig
- De opname dia wordt geplaatst onder de microscoop en geperfuseerd met Ringer-oplossing door middel van een zwaartekracht perfusie syste
- Het preparaat is gevisualiseerd met een rechtopstaande microscoop met een 10x en 40x water immersie objectief.
- Nogmaals, we alleen gebruik maken van infrarood licht om te voorkomen dat bleken van de fotoreceptoren. Een IR-camera is bevestigd aan de zijkant poort van de microscoop, die is aangesloten op een TV-scherm.
Visuele stimulatie
Visuele stimuli zijn geprogrammeerd in Matlab met behulp van de Psychtoolbox en worden geprojecteerd op het netvlies door de bovenkant poort van de microscoop met behulp van een microscopie afbeelding injector (MBF bioscience). A + + bits Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) wordt gebruikt om een 14bit luminantie schaal te verkrijgen en te synchronize stimulus presentatie met data-acquisitie. De visuele stimuli die in deze video zijn heldere of donkere balken (width = 460μm) van 100% contrast, die gedurende twee seconden gepresenteerd op een stabiele uniforme achtergrond (luminantie = 8 * 10 4 fotonen / um / s, afmetingen: 1,84 x 1.38mm).
Elektrofysiologie
- Patch elektroden zijn getrokken uit borosilicaat glas (OD:.. 1,5 mm, ID 84mm) met een micropipet trekker. Voor de ganglioncellen, weerstanden liggen tussen de 2 en 4 Mohm. Voor bipolaire cellen, zijn hoger weerstanden tussen de 4 en 8 Mohm gebruikt.
- Voltage Clamp opnames worden uitgevoerd met behulp van een Multiclamp 700A (Molecular Devices), versterker en lab interne software geprogrammeerd in Labview.
- Drugs zijn perfusie via een 8-kanaals perfusie-systeem. De microperfusion elektrode ligt dicht geplaatst om de slice (het weefsel moet zichtbaar beweegt wanneer u de perfusie-en uitschakelen, maar moet men oppassen dat de druk niet te sterk, zodat de plak los kunnen raken van het filter papier). Tijdens experimenten de microperfusion moet voortdurend ingeschakeld (perfuseren controle-oplossing als er geen drugs nodig zijn), zodat de opname niet gestoord door het inschakelen van de perfusie-en uitschakelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voordelen:
- Alle celtypen zijn toegankelijk
- Eenvoudige identificatie van celtypen, met name wanneer een fluorescerende kleurstof wordt toegevoegd aan de elektrode oplossing
- Farmacologische middelen gemakkelijk kunt bereiken doelcellen
- De patch clamp techniek maakt het mogelijk om de rol van verschillende ionenkanalen te onderzoeken in het netvlies berekeningen. Dezelfde informatie kan niet worden verkregen via extracellulaire spike-opnamen of opnamen met scherpe elektroden.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere diermodellen
Nadelen:
- Processen kunnen krijgen afgesneden in het proces van snijden. Daarom kunnen de studies die zich richten op de ruimtelijke receptieve veld moeilijk zijn.
- Zoals in de meeste netvlies in-vitro-preparaten die voor de elektrofysiologie, is het pigment epitheel verwijderd, wat kan leiden tot bleken van fotoreceptoren. Studies die stimulatie nodig hebben met een hoge lichtintensiteit of noodzaak om het netvlies onderzoek onder vele aanpassing staten zou kunnen lopen in de problemen met deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus Corporation | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Microscope image injector | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes, Life Technologies | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
