Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

Summary

Ici, nous montrons notre méthode pour isoler la souris épiderme des cellules souches neurales de crête (EPI-NCSC). Technique consiste à micro-dissection follicules moustaches, isoler le renflement et il placeing en culture de tissus. EPI-NCSC commencent à émigrer à partir d'explants renflement sur le substrat dans les 3 - 4 jours.

Abstract

EPI-NCSC sont des vestiges de la crête neurale embryonnaire dans un endroit adulte, le renflement des follicules pileux. Ce sont des cellules souches multipotentes qui ont la propriété physiologique de générer un large éventail de types de cellules différenciées, y compris les neurones, les cellules nerveuses de soutien, les cellules musculaires lisses, les os / les cellules du cartilage et des mélanocytes. EPI-NCSC sont facilement accessibles dans la peau velue et peut être isolé comme une population très pures de cellules souches. Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour la préparation de la souris EPI-NCSC cultures de follicules moustaches. Le pad moustaches d'une souris adulte est enlevée, et les follicules moustaches disséqués. Les follicules sont ensuite coupées longitudinalement et transversalement par la suite au-dessus et en dessous de la région de renflement. Le renflement est retiré de la capsule de collagène et placé dans une plaque de culture. EPI-NCSC commencent à émigrer de l'explants renflement 3 à 4 jours plus tard.

Protocol

Dissection des Ardennes de follicules adultes Whisker souris

1. Nous utilisons 10 semaines à 6 mois des souris âgées. Les jeunes souris produisent souvent plusieurs cellules. Euthanasier les animaux de la souris et plongez dans l'ensemble du mélange 1:1 bétadine (solution d'iode) et du peroxyde d'hydrogène (disponible à la pharmacie) pendant environ 3 minutes.
   
2. Squirt souris entier, en particulier la région du visage, avec de l'éthanol 75%, et de la souris pour effectuer microscope à dissection dans une hotte à flux laminaire.
3. Disséquer babines, en évitant soigneusement de couper en bulbes pileux, et piscine dans HBSS.
4. Disséquer follicules moustaches et une piscine dans HBSS à température ambiante. Pour ce faire, en tenant la peau à côté de follicule pileux avec une pince, puis découpe autour du follicule avec les ciseaux droits. Couper en profondeur pour éviter de blesser les bulbes pileux.
5. Ascenseur follicule moustaches de pad moustaches et mis en nouvelle plaque avec HBSS frais.
6. Rincer adipeux lâche et de tissu cutané avec jets de tampon, jusqu'à ce que les follicules moustaches sont propres. Si nécessaire, couper nerf follicule moustaches et éliminer les tissus adhérentes par grattage et bouffées répétées de HBSS.
7. Pin follilce cheveux propres sur Sylgard verre enduit boîte de Petri en utilisant des aiguilles de tungstène affûté, en utilisant microforceps pour la tenue de la peau sur la partie à côté du follicule.
8. Moustaches coupées follicule longitudically avec un microlames. Évitez de couper trop profondément, car cela va blesser le bulbe. Retirer le sang gicle avec répétées de HBSS jusqu'à allé. Apparition de sang est une bonne indication que la coupe était assez profonde. Si la coupe longitudial n'est pas suffisamment longue, il peut être rallongé avec microciseaux plié.
9. Faites une coupe transversale au-dessus du niveau du sinus caverneux et ensuite une deuxième coupe transversale au niveau des sinus dans le ring, près de la peau.
10. Vous allez maintenant voir le renflement intérieur de la capsule.
11. Prenez une fin de capsule de collagène d'avec la pince et le déploiement du bulbe avec une aiguille de tungstène plié. Vous allez maintenant voir la capsule vide et le renflement isolés.
12. Piscine isolés renflements dans une plaque de culture séparés dans HBSS à température ambiante. Assurez-vous qu'aucun autre tissu contamine les renflements en commun.

Culture d'explants bulbe

1. Manteau 35 mm des plaques de culture avec du collagène en plaçant 50 collagène ul et 10 ul stérile 6% de NaCl côté de l'autre. Mélangez bien avec une pipette à double plié Pasteyr et pousser vers le bord de la plaque de culture. Incuber une nuit dans un dessiccateur propre, mais ne laissez pas sécher. Avant utilisation, rincer les plaques avec une solution saline.
2. Pré-incuber des plaques de culture revêtus de collagène et rincés pendant environ 3 heures avec un milieu de culture. Le milieu de culture est constitué de 85% d'alpha-MEM modifiés, 10% de sérum de veau fœtal et 5% jour 11 d'extrait d'embryon de poulet.
3. Après ré-incubation, éliminer le milieu de culture à partir de plaques et d'ajouter plusieurs renflements moyenne aussi peu que possible. Retirer l'excès milieu de culture.
4. Incuber pendant 1 heure, mais pas plus, dans la cellule incubateur dans une atmosphère humidifiée avec de l'oxygène 10% et 5% de CO _2.
5. Après 1 heure, doucement ajoutez 1,5 ml de milieu de culture. Explants Ardennes devraient adhérer au substrat de collagène. Remplacer 50% du milieu de culture quotidienne.
6. Dans les 3 - 4 jours, les cellules hautement migratoires vont émigrer de l'explants renflement. Notez leur morphologie stellaire, la motilité, et l'absence prédominante de contacts cellule-cellule. Au cours des prochains jours, plus de cellules d'émigrer, et a émigré cellules vont proliférer rapidement.
7. Retirer renflement 2 - 3 jours après l'apparition des EPI-NCSC l'émigration avec une aiguille de tungstène affûté. Si les renflements sont laissés plus longtemps, ils ont tendance à s'aplatir et à rendre impossible à obtenir purs EPI-NCSC cultures.
8. Important: rares cellules avec une morphologie aplatie, qui deviennent parfois apparente plusieurs jours plus tard EPI-NCSC, et qui sont moins mobiles ne sont PAS EPI-NCSC, mais putatifs cellules souches épidermiques / progéniteurs. Cultures composée de ces cellules, ou des cultures mixtes contenant du PEV-NCSC et putatifs cellules souches épidermiques / progéniteurs doivent être jetés.
9. Astuce: Ne pas garder les cellules pendant trop longtemps dans le milieu de explant primaire, car elles tendent à se différencier rapidement à haute densité cellulaire, en raison de putativement autocrine / paracrine de signalisation du facteur de croissance.

Discussion

En vertu de leur capacité migratoire, EPI-NCSC peut être isolé comme une population très pure de cellules souches, qui peuvent être développées in vitro. Comme vestiges embryonnaires dans un endroit adulte, EPI-NCSC sont des candidats potentiellement intéressants pour l'avenir de thérapies de remplacement cellulaire, le génie biomédical et / ou la médecine régénérative. Nous avons testé le PEV-NCSC dans un modèle murin de lésion de la moelle épinière, où elles présentent des traits désirables. Grâce profilage de l'expression génique par LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / géo, numéro de série GSE4680) nous avons montré que, comme attendu, des cellules embryonnaires de la crête neurale et EPI-NCSC part un modèle de gène similaire expression qui diffère de celle des voisins cellules souches épidermiques et d'autres cellules de la peau résidents souches / progéniteurs.