Isolatie van Vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en AGM

Summary

Deze video laat zien hoe de dooierzak en de aorta-gonaden-mesonephros regio micro-ontleden van embryo's en het gebruik flowcytometrie om hematopoietische stamcellen te sorteren.

Abstract

In de muis embryo, vroeg hematopoiese komt gelijktijdig in meerdere organen, die de dooierzak en de aorta-gonaden-mesonephros regio omvat. Deze regio's zijn cruciaal bij het vaststellen van het bloed in de embryo's en leidt tot de uiteindelijke verplaatsing van stamcellen in de foetale lever en vervolgens de ontwikkeling van volwassen stamcellen in het beenmerg. Begin van de hematopoietische stamcellen kunnen geïsoleerd worden uit deze organen door microdissectie van het embryo, gevolgd door flowcytometrische sorteren om een ​​meer zuivere populatie te verkrijgen. Het blijft onduidelijk hoe deze stamcelpopulaties bijdragen aan de foetale en volwassen stamcellen zwembad. Ook ons ​​lab onderzoekt hoe vroeg stamcellen functioneel afwijken van de foetale en volwassen hematopoietische stamcellen. Bovendien, onze lab allerlei verschillende populaties van hematopoietische stamcellen en testen hun functionele rol in het kader van een variëteit van genetische modellen. In deze video, tonen we de micro-dissectie procedure die wij vaak gebruiken en toont ook de resultaten van een typisch FACS plotfter isoleren van deze zeldzame populaties, is het mogelijk om een ​​scala aan functionele testen, waaronder: kolonie assays en beenmergtransplantaties.

Protocol

Dissectie en isolatie van vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en aorta-gonaden-mesonephros regio

1. Voordat u begint, is het belangrijk om alle reagentia en instrumenten die nodig zijn voor de procedure:
   
   • Schaar
   • Tang, maat 4, en chirurgische kwaliteit gebogen tip pincet, maat 5 / 45 (optioneel)
   • 30 gauge naalden met spuit
   • 35mm en 100mm Petrischalen
   • PBS met 10% en 20% foetaal runderserum
   • en ten slotte, Collagenase
2. Om te beginnen de dissectie, moeten we de baarmoederhoorns oogst van een zwangere vrouw op 10,5 dagen na de conceptie.
3. Dieren worden gedood volgens goedgekeurde procedures. We maken gebruik van kooldioxide stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
4. De vrouwelijke buik nat is met ethanol en de huid wordt geopend met een schaar.
5. Houd de huid met een tang, zijn extra bezuinigingen aan het buikvlies te openen.
6. De buik is geopend en de baarmoeder hoornen kunnen worden gevisualiseerd. Met behulp van een tang om de baarmoeder hoornen te houden, snijd elke distale uiteinde en het centrum te accijnzen beide hoorns.
7. Baarmoederhoorns worden dan geplaatst in een petrischaal met koude PBS met 10% FBS om de baarmoeder weefsel te verwijderen.
8. Met behulp van grootte 4 tang en werken onder de microscoop, verwijder voorzichtig het endometriumweefsel uit de hele elk embryo Conceptus, zorg dat u doorboren van de placenta.
9. Eenmaal verwijderd, worden de embryo's geplaatst in een verse schotel met koude PBS en 10% FBS.
10. Verwijder voorzichtig de placenta weefsel te onthullen het embryo ingekapseld in de dooierzak met behulp van de tang om de embryo-ingekapseld dooierzak wegsnijden uit de placenta op hun moment. De dooierzak met vitelline slagaders, en een deel van de navelstreng, voorzichtig kunnen worden geplaagd weg van het embryo en gereserveerd op het ijs voor de dissociatie.
11. Het embryo wordt verplaatst naar een kleine petrischaal met een minimale niveaus van PBS met 10% FBS - net genoeg om de embryo nat, maar niet te veel. Optimale niveaus te houden van de embryo stationair, terwijl de plaat langzaam opgewonden, het bijhouden van de embryo veilig op zijn plaats tijdens de dissectie.
12. Schakel over naar de 30 gauge naalden, die worden gebruikt om de bovenste en onderste delen van het embryo te verwijderen door te snijden boven de voorpoten en onder de achterpoten. Vertrouwd te raken met het gebruik van de naalden als snij-instrumenten kan enige oefening. Een methode voor het gebruik van herhaalde kleine sneetjes door het kruisen van de naalden zal ontleden het weefsel, met de naald gehouden in de dominante hand op te treden als een gids voor het snijden van de naald die wordt gehouden in de niet-dominante hand.
13. Verwijder het dorsale gedeelte van het embryo. Dit is het weefsel dat de somieten bevat. Voorzichtig wegknippen van de dorsale meest weefsel, terwijl de resterende een voldoende afstand van de aorta (rode lijn) om Knicks te voorkomen. Het snijden van de aorta zou resulteren in verlies van bloed en het onvermogen om gemakkelijk te visualiseren zijn locatie. Nogmaals, het maken van kleine delen, met de naalden is van vitaal belang voor het behoud van een nauwkeurig snijden locatie.
14. Duw de extra weefsel weg uit het zicht en draai het embryo rond naar de ventrale weefsel snijden, snijden weer zo dicht mogelijk bij de aorta mogelijk zonder knicking het. Het mes gezet te ver van de optimale locatie zou resulteren in de buik weefsel aanwezig, die kan worden verwijderd zodra de AVA is geïsoleerd.
15. Positie van het embryo met de rug naar beneden of haar rug tegen de plaat. Voorzichtig splay het embryo te openen door op de zijkanten naar beneden en visualiseren van de locatie van de gonadale richels. Deze zijn iets zich niet in het midden als tube-achtige structuren aan weerszijden van de aorta.
16. Voltooi de dissectie door het verwijderen van het overtollige kant weefsels met dezelfde snij-technieken als voorheen. Zodra de kant weefsel van het embryo wordt verwijderd, dan is het embryo op zijn kop gezet om de resterende kant weefsel te verwijderen.
17. Op dit punt is de AVA worden gecontroleerd op overtollige weefsel dat eenvoudig kan worden verwijderd met de naalden, zonder schade aan de aorta of de geslachtsklieren. Het verwijderen van zoveel overtollige mogelijk resulteert in een betere isolatie van de stamcellen bevolking sinds we rekenen op slechts een paar celoppervlaktemerkers voor zuivering.
18. Met behulp van de gebogen tip pincet voorzichtig schep er elke AGM en plaats in koude PBS met 10% FBS tot aan dissociatie.

Dissociatie en FACS-analyse

1. Te dissociëren het weefsel, eerste plaats dooier zakken en de algemene vergaderingen in aparte buizen.
2. Spin kort aan pellet weefsels en gooi PBS met 10% FBS.
3. Resuspendeer weefsels in 0,25% collagenase in PBS met 20% FBS, met genoeg volume om voldoende af te dekken weefsels.
4. Incubeer de weefsels op 37 graden. 25-30 minuten voor de algemene vergaderingen van aandeelhouders en de 35-40mins voor eigeel zakken.
5. Aan het eind van de incubatie, zacht weefsel pipet op en neer om dissociatie in enkele celsuspensies.
6. Was de weefsels met een overmaat PBS wiste 10% FBS, pellet de cellen en resuspendeer in verse steriele PBS met 10% FBS.
7. Voor de FACS-analyse, worden cellen gekleurd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. We maken gebruik van een FACSAria van BD Biosciences naar flowcytometrie uit te voeren. Vanwege de omvang en de kwetsbaarheid van de embryonale cellen, is het sorteren diafragma aangepast voor een grotere diameter dan voor volwassen hematopoietische cellen, die we ook bestuderen in het lab. Ook wordt de druk aangepast aan minder zijn dan de voorwaarden van volwassen hematopoietische cellen. Bijvoorbeeld, het sorteren op de FACSAria, zou de nozzle grootte zijn 100 micron en het soort druk zou zijn 30 psi.
8. Voor stamcellen analyses, triple positieve cellen die de markers cKit, CD34 en CD41 zijn geïsoleerd en gesorteerd van de dooierzak en dubbele positieven (cKit, CD34) zijn geïsoleerd van de Algemene Vergadering van Aandeelhouders via FACS. Een typische plot zou er als volgt uitzien: cKit positieve cellen worden geanalyseerd voor CD34 en CD41 tegelijk of individueel. Meestal cellen vertonen een gradatie van positiviteit voor elke marker met de stamcel populatie gevonden als een subset van de positieve populaties. Deze percelen laten ons zien dat we een goede cel opbrengst gerealiseerd met 100-300 cellen per dooierzak en per AVA.