Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

Summary

이 비디오는 태아의 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 영역을 미세 절개하다 및 조혈 줄기 세포를 정렬 유동세포계측법를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

마우스 배아에서 초기 조혈은 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 영역을 포함 여러 장기에 동시에 발생합니다. 이 지역은 태아의 혈액 시스템을 구축에 중요하고 태아 간 다음 bonemarrow의 성인 줄기 세포의 개발에 줄기 세포의 최종 움직임에 이르게한다. 초기 조혈 줄기 세포는 이러한 기관에서보다 순수한 인구를 얻는 흐름 cytometric 정렬 뒤에 배의 microdissection을 통해 격리 수 있습니다. 그것은 이러한 줄기 세포 인구가 태아와 성인 줄기 세포 수영장에 기여하는 방법을 명확 남아있다. 또한, 우리 연구소는 초기 줄기 세포가 기능 태아 및 성인 조혈 줄기 세포 차이가 어떻게 조사. 또한, 우리 실험실 종류의 조혈 줄기 세포의 다른 인구 및 유전자 모델의 다양한 맥락에서 자신의 기능 역할을 테스트합니다. 콜로니 assays 및 골수 이식 :이 비디오는, 우리가 일반적으로 사용하고 이러한 희귀한 인구를 분리 전형적인 외과의 plotfter의 결과를 보여 마이크로 절개 절차를 보여줍니다, 그것은 포함한 기능 assays 다양한 수행할 수 있습니다.

Protocol

murine 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 지역에서 초기 조혈 줄기 세포의 해부 및 절연

1. 시작하기 전에 프로 시저에 필요한 모든 시약과 도구를 가지고하는 것이 중요합니다 :
   
   • 가위
   • 집게, 크기 4 및 수술 성적 벤트 - 스쳐 포셉, 크기 45분의 5 (옵션)
   • 주사기 30 게이지 바늘
   • 35mm와 100mm 페트리 접시
   • PBS 10 % 20% 태아 소 혈청과
   • 그리고 마지막으로, Collagenase
2. 절개를 시작하려면, 우리는 10.5 일 우편 개념에서 임신 여성에서 자궁 뿔을 수확해야합니다.
3. 동물이 승인 절차에 따라 euthanized 있습니다. 우리는 자궁 경부 전위 다음 이산화탄소 질식을 사용합니다.
4. 여성의 복부는 에탄올와 젖은이고 피부는 가위로 열립니다.
5. 포셉로 피부를 개최, 추가 인하는 복막을 엽니다 만들어집니다.
6. 복부가 열립니다과 자궁 뿔이 시각하실 수 있습니다. 자궁 뿔 잡고 집게를 사용하여, 각 말초 엔드 및 소비세 모두 뿔을를 중심 잘라.
7. 자궁 뿔 그런 다음 자궁 조직을 제거 10 % FBS와 차가운 PBS를 포함하는 페트리 접시에 배치됩니다.
8. 크기 4 포셉를 사용하여 현미경으로 작동, 부드럽게하지 소중히 태반를주의하고, 각각의 배아 conceptus 주변에서 자궁 내막 조직을 제거합니다.
9. 일단 제거, 배아는 차가운 PBS와 10 % FBS와 신선한 접시에 배치됩니다.
10. 조심스럽게 배아 떠나 자신의 시점에서 태반에서 태아 - 쌌다는 난황를 잘라 집게를 사용하여 난황으로 ​​쌌다 나타내기 위해 placental 조직을 제거합니다. vitelline의 동맥과 탯줄의 일부를 포함하는 난황은 부드럽게 배아 떨어져 조롱과 분리를위한 얼음에 별도로 설정할 수 있습니다.
11. 배아는 10% FBS와 PBS의 최소한의 수준 작은 페트리 접시로 이동 - 단지 충분 배아를 엿먹일 수 있지만 너무 많이는 말고. 접시가 천천히 해부 동안에 안전하게 배아를 유지, 흥분 상태에서 최적의 수준은 배가 정지 유지.
12. 앞발 위와 hindlimbs 아래 절단하여 배 (胚)의 상단과 하단 부분을 제거하는 데 사용되는 30 게이지 바늘로 전환합니다. 절삭 악기로 바늘을 사용하여 익숙한되기 위해서는 연습이 걸릴 수 있습니다. 바늘을 횡단하여 반복 작은 상처를 사용하는 방법은 비 지배적인 손에 개최되는 바늘 절단 가이드 역할을 주로 사용하는 손이에서 개최된 바늘과 조직을 해부하다 것입니다.
13. 배아의 지느러미 부분을 제거합니다. 이것은 somites을 포함하는 조직입니다. 어떤 닉스를 방지하기 위해 대동맥 (빨간색 선)에서 충분한 거리를 유지하면서 부드럽게 지느러미 - 대부분의 조직을 버려야. 대동맥을 절단하는 것은 혈액의 손실 쉽게 위치를 시각화하는 무능력을 초래합니다. 다시 바늘로 작은 상처를 만드는 것은 정확한 절단 위치를 유지하기 위해 매우 중요합니다.
14. 밖으로보기의 거리에 여분의 조직을 푸시하고 ​​다시 그것을 knicking 않고 가능한 대동맥 가까운 절단, 복부 조직을 잘라 배아를 돌아서. 상처는 너무 멀리 최적의 위치에서 AGM가 격리되면 제거할 수 있습니다 존재 복부 조직, 초래 하리라는했다.
15. 플레이트에 대해 아래의 지느러미 쪽 또는 다시와 배아를 놓습니다. 부드럽게 측면을 추진하고 gonadal 산등성이의 위치를​​ 시각화하여 열고 배아를 넓히다. 이러한 대동맥의 양쪽에 튜브와 같은 구조로 중심을 벗어난 약간 있습니다.
16. 이전과 같은 가공 기술을 사용하여 여분의 측면 조직​​을 제거하여 절개를 완료합니다. 배아의 측면 조직​​이 제거되면 다음 배아가 남아있는 측면 조직​​을 제거하기 위해 거꾸로 켜집니다.
17. 이 시점에서, AGM은 대동맥이나 생식선에 부상하지 않고 바늘로 쉽게 제거할 수있는 여분의 조직을위한 검사입니다. 우리가 정화에 대해서만 몇 세포 표면 마커에 의존 이후 줄기 세포 인구의 더 나은 분리 가능 결과 많은 초과로 제거.
18. 벤트 - 스쳐 집게를 사용하여 부드럽게 분리 준비까지 10% FBS와 차가운 PBS 각 AGM과 장소를 특종.

분리 및 분석 외과

1. 별도의 튜브에있는 조직, 첫번째 장소 노른자의 주머 니나와 AGMs을 떼어 놓다합니다.
2. 펠렛 조직을 간략하게 스핀와 10 % FBS와 PBS를 버리고.
3. 적절하게 조직을 감추기에 충분 할만큼 볼륨, 20 % FBS와 PBS에 0.​​25 %의 collagenase의 조직을 Resuspend.
4. 37도에서 조직을 품어. 난황 주머 니나에 대한 AGMs 35 - 30-40 분 25 - 30 분.
5. 부화의 끝 부분에서 부드럽게 조직을 피펫 아래로 분리하는 단세포 suspensions에.
6. 초과 PBS 위스콘신과 조직 와시일 10% FBS, 펠렛 10% FBS 신선한 멸균 PBS에 세포 resuspend.
7. 외과의 분석을 위해, 전지는 제조 업체의 권장 사항에 따라 얼룩이 있습니다. 우리는 유동세포계측법을 수행하는 BD Biosciences에서 FACSAria을 사용합니다. 배아 세포의 크기와 취약성으로 인해, 정렬 조리개 우리가 또한 실험실에서 공부 성인 조혈 세포에 대한보다 큰 직경을 위해 조정됩니다. 마찬가지로, 압력은 성인 조혈 세포에 필요한 조건보다 적은 것으로 조정됩니다. 예를 들어, FACSAria에 정렬, 노즐의 크기는 100 미크론 및 정렬 압력 30 PSI 될 것입니다.
8. 줄기 세포 분석은 마커의 cKit, CD34, CD41 표현 및 트리플 긍정적인 세포가 고립되고 난황 더블 반응 (cKit, CD34)의 정렬은 외과 통해 AGM에서 격리됩니다. 전형적인 줄거리는 이런 모양이 될 : cKit 긍정적인 세포는 CD34과 동시에 또는 개별적으로 CD41에 대한 분석입니다. 보통 세포는 긍정적인 인구의 일부로 발견된 줄기 세포 인구 각 마커에 대한 양성의 그라데이션을 표시합니다. 이러한 플롯 우리가 난황과 당 AGM 당 100-300 세포와 좋은 세포 수율을 달성한다는 우리에게 보여줍니다.