Biology

Изоляция раннего гемопоэтических стволовых клеток мышей желточного мешка и AGM

Published: June 27, 2008 doi: 10.3791/789

Kelly Morgan¹, Michael Kharas¹, Elaine Dzierzak², D. Gary Gilliland^1,3

¹Department of Hematology and Oncology, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, ²Department of Cell Biology and Genetics, Erasmus University Medical Center, ³Department of Medicine, Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

Summary

Это видео показывает, как микро-рассекать желточного мешка и аорто-гонады-мезонефрос региона из эмбрионов и использование проточной цитометрии для сортировки гемопоэтических стволовых клеток.

Abstract

В эмбриона мыши, рано кроветворения происходит одновременно в нескольких органах, которая включает в себя желточного мешка и аорто-гонады-мезонефрос регионе. Эти регионы имеют решающее значение в создании системы крови у эмбрионов и приводит к возможному движению стволовых клеток в эмбриональной печени, а затем развитие взрослых стволовых клеток в bonemarrow. Рано гемопоэтических стволовых клеток может быть изолирована от этих органов через микродиссекции эмбрион затем проточной цитометрии сортировки для получения более чистой населения. Остается неясным, как эти популяции стволовых клеток, способствуют плода и взрослого бассейна стволовых клеток. Кроме того, наша лаборатория исследует, как рано стволовых клеток функционально отличаются от эмбриональных и взрослых гемопоэтических стволовых клеток. Кроме того, наша лаборатория видов различных групп населения гемопоэтических стволовых клеток и проверить их функциональной роли в рамках различных генетических моделей. В этом видео, мы демонстрируем микро-рассечение процедуру мы обычно используем, а также представлены результаты типичного plotfter FACS изоляции этих популяций редких, можно выполнять различные функциональные тесты в том числе: колония анализов и трансплантации костного мозга.

Protocol

Разбор и изоляции ранних гемопоэтических стволовых клеток из мышиной желточного мешка и аорто-гонады-мезонефрос регионе

Перед тем как начать, важно, чтобы все реактивы и инструменты, необходимые для процедуры:
- Ножницы
- Пинцет, размер 4, и хирургические класса бент-наконечником щипцы, размер 5 / 45 (опционально)
- 30 иглы со шприцем
- 35-мм и 100 мм чашки Петри
- PBS с 10% до 20% эмбриональной телячьей сыворотки
- и, наконец, коллагеназы
Для начала вскрытия, мы должны собрать рогов матки от беременных женщин на 10,5 концепции сообщение дней.
Животных усыпляют в соответствии с утвержденными процедурами. Мы используем углекислого газа удушья, после чего шейки дислокации.
Животе самки влажная этанолом и кожа открыта с помощью ножниц.
Холдинг кожу щипцами, дополнительные разрезы сделаны, чтобы открыть брюшины.
Живот открыт и рогов матки могут быть визуализированы. Использование щипцов провести рогов матки, разрезать каждый дистального конца и центра акцизного оба рога.
Маточные рога затем помещается в чашку Петри содержащих холодного PBS с 10% FBS для удаления матки тканей.
Использование размером 4 щипцов и работающих под микроскопом, аккуратно удалить эндометрия ткани вокруг каждого эмбриона зародыш, стараясь не прокол плаценты.
После удаления, эмбрионы помещают в свежее блюдо с холодным PBS и 10% FBS.
Осторожно снимите плацентарной ткани выявить эмбрион, заключенная в желточный мешок с помощью щипцов, чтобы сократить эмбриона-заключенная желточного мешка от плаценты на их этапе. Желточного мешка содержащие желточной артерий, а часть пуповины, может быть слегка дразнили от эмбриона и отложите на льду для диссоциации.
Эмбрион переносится в небольшой чашке Петри с минимальным уровнем PBS с 10% FBS - ровно настолько, чтобы мокрая эмбриона, но не слишком много. Оптимальные уровни сохранить эмбрион в то время как стационарная плита медленно взволнован, сохраняя эмбрион надежно на месте во время вскрытия.
Переключить на 30 иглы, которые используются для удаления верхних и нижних частей эмбриона, сокращая выше передних и задних конечностей ниже. Знакомство с использованием игл в качестве режущего инструмента может занять некоторое практике. Метод использования повторяющихся мелких порезах, пересекая иглы будут рассекать ткани, с иглой состоялась в доминирующую руку в качестве руководства для резки иглой, которая проходит в не доминантной рукой.
Удалить спинной части эмбриона. Это ткань, которая содержит сомитов. Аккуратно срезать спинные-самые ткани, оставаясь при этом достаточно далеко от аорты (красная линия), чтобы предотвратить любые Никс. Резка аорты может привести к потере крови и неспособность легко визуализировать его местоположение. Опять же, делая небольшие разрезы с иглы имеет жизненно важное значение для поддержания точного местонахождения резки.
Нажмите дополнительной ткани прочь из поля зрения и повернуть вокруг эмбриона, чтобы сократить вентральной ткани, опять же резки, как близко к аорте насколько это возможно без knicking его. Порезы сделали слишком далеко от оптимального расположения приведет к брюшной ткани присутствуют, который может быть удален после годового общего собрания акционеров является изолированной.
Позиция эмбриона с его спинной стороной вниз или его спиной к тарелке. Мягко скошенный эмбриона открыты нажатием стороны вниз и визуализации расположения половых хребтов. Они расположены слегка смещено от центра трубки-подобных структур по обе стороны от аорты.
Полное вскрытие, удалив избыток тканей стороне с использованием тех же методов резки, как раньше. Как только стороны ткани эмбриона удаляется, после чего эмбрион с ног на голову, чтобы удалить оставшиеся ткани стороне.
На данный момент, AGM это проверяется на наличие избыточной ткани, которые могут быть легко удалены с иглами без ущерба для аорты или половых желез. Удаление, как много лишнего, как возможные результаты в лучшую изоляцию населения стволовых клеток, так как мы полагаемся только на нескольких поверхности клеток маркеры для очистки.
Использование изогнутых наконечником пинцетом, осторожно зачерпнуть каждого годового общего собрания акционеров и поставить в холодную PBS с 10% FBS вплоть до момента его диссоциации.

Диссоциация и FACS анализ

Чтобы отделить ткани, первое место желток мешки и AGMs в отдельных трубках.
Спиновые кратко гранул тканей и отбросить PBS с 10% FBS.
Ресуспендируют ткани в 0,25% коллагеназы в PBS с 20% FBS, с достаточным объемом, чтобы обеспечить должный охват тканей.
Инкубируйте ткани при температуре 37 градусов. 25-30 мин для AGMs и 35-40mins для желтком мешки.
В конце инкубации, мягко пипетки тканей вверх и вниз, к распаду на отдельные суспензии клеток.
Вымойте тканей с избыточным PBS шго 10% FBS, пеллет клетки и ресуспендируют в свежей стерильной PBS с 10% FBS.
Для анализа FACS, клетки окрашиваются в соответствии с рекомендациями производителя. Мы используем FACSAria от BD Biosciences для выполнения проточной цитометрии. Из-за размеров и хрупкости эмбриональных клеток, сортировка диафрагмы с поправкой на больший диаметр, чем для взрослых гемопоэтических клеток, которые мы также исследование в лабораторию. Кроме того, давление регулируется быть меньше, чем условия, требуемые для взрослых гемопоэтических клеток. Например, сортировка по FACSAria, размер сопла бы 100 микрон и рода давление составит 30 фунтов на квадратный дюйм.
Для анализа стволовых клеток, трех положительных клеток, экспрессирующих маркеры cKit, CD34, CD41 и изолированы и сортируются от желтка и дважды срабатываний (cKit, CD34) изолированы от годового общего собрания акционеров через СУИМ. Типичный график будет выглядеть следующим образом: cKit положительных клеток анализируются на CD34 и CD41 одновременно или по отдельности. Обычно клетки отображения градаций положительности для каждого маркера с населением стволовых клеток находится как подмножество положительных населения. Эти графики показывают нам, что мы добились хорошего урожая ячейки с 100-300 клеток на желточный мешок и на ГОСА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.