Summary
Aqui nós relatamos a geração de Tre recombinase através dirigido evolução, molecular. Tre recombinase reconhece uma seqüência alvo pré-definido dentro das sequências LTR do pró-vírus HIV-1, resultando na excisão e erradicação do provírus de células humanas infectadas. Enquanto ainda em sua infância, dirigido a evolução molecular irá permitir a criação de enzimas personalizadas que servirão como ferramentas de cirurgia e medicina molecular molecular.
Abstract
Aqui nós relatamos a geração de Tre recombinase através dirigido evolução, molecular. Tre recombinase reconhece uma seqüência alvo pré-definido dentro das sequências LTR do pró-vírus HIV-1, resultando na excisão e erradicação do provírus de células humanas infectadas.
Começamos com Cre, a recombinase 38 kDa, que reconhece uma seqüência de 34 pb DNA double-stranded conhecido como loxP. Cre porque pode efetivamente eliminar seqüências genômicas, nos propusemos a adaptar um recombinase que poderia remover a seqüência entre o 5'-LTR e 3'-LTR de um provírus HIV-1 integrado. Como uma primeira etapa foram identificadas seqüências dentro dos locais LTR que foram semelhantes aos loxP e testado para a atividade de recombinação. Inicialmente Cre e bibliotecas mutagenizados Cre não recombinar os locais escolhidos loxLTR do pró-vírus HIV-1. Como o início de qualquer processo de evolução molecular dirigida requer, pelo menos, a atividade residual, o original seqüências loxLTR assimétrica foram divididos em subgrupos e testadas novamente para a atividade de recombinação. Atuando como intermediários, a atividade de recombinação foi mostrado com os subconjuntos. Em seguida, bibliotecas recombinase foram enriquecidos por ciclos evolução reiterativa. Posteriormente, as bibliotecas foram enriquecidas embaralhadas e recombinados. A combinação de diferentes mutações provou sinérgicos e recombinases foram criados que foram capazes de recombinar loxLTR1 e loxLTR2. Esta era uma evidência de que uma estratégia evolutiva através de intermediários pode ser bem sucedido. Após um total de 126 ciclos de evolução recombinases individuais foram analisados funcionalmente e estruturalmente. A recombinase mais ativos - Tre - teve 19 mudanças de aminoácidos, em comparação com Cre. Tre recombinase foi capaz de extirpar o provírus HIV-1 a partir do genoma do HIV-1 células infectadas HeLa (ver "HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virologia e Imunologia, Hamburgo, Alemanha). Enquanto ainda em sua infância, dirigido a evolução molecular irá permitir a criação de enzimas personalizadas que servirão como ferramentas de "cirurgia molecular" e medicina molecular.
