Summary
Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen. Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der molekularen Chirurgie und Molekulare Medizin dienen.
Abstract
Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen.
Wir begannen mit Cre, ein 38-kDa-Rekombinase, dass ein 34-bp doppelsträngige DNA-Sequenz als loxP bekannt erkennt. Da Cre effektiv beseitigen kann genomischen Sequenzen, machten wir uns auf maßgeschneiderte Rekombinase, dass die Sequenz zwischen der 5'-LTR und 3'-LTR eines integrierten HIV-1 Provirus entfernen konnte. In einem ersten Schritt haben wir identifizierten Sequenzen innerhalb des LTR Sites, die ähnlich loxP und getestet für die Rekombination Aktivität wurden. Zunächst Cre und mutagenisierten Cre-Bibliotheken nicht auf die gewählte loxLTR Seiten des HIV-1 Provirus rekombinieren. Da der Start einer gerichteten molekularen Evolution Prozess erfordert mindestens Restaktivität wurden die ursprünglichen asymmetrischen loxLTR-Sequenzen in zwei Teilmengen und erneut geprüft für die Rekombination Aktivität. Als Zwischenprodukte, war Rekombination Aktivität mit der Teilmengen gezeigt. Als nächstes Rekombinase-Bibliotheken wurden durch reiterative Evolution Zyklen bereichert. Anschließend wurden angereichert Bibliotheken gemischt und neu kombiniert. Die Kombination verschiedener Mutationen nachgewiesen synergistische und Rekombinasen entstanden, die konnten loxLTR1 und loxLTR2 rekombinieren. Das war Beweis dafür, dass eine evolutionäre Strategie durch Zwischenprodukte erfolgreich sein kann. Nach insgesamt 126 Evolution Zyklen einzelner Rekombinasen waren funktionell und strukturell analysiert. Die aktivsten Rekombinase - Tre - hatten 19 Aminosäure-Veränderungen zu Cre verglichen. Tre-Rekombinase konnte Verbrauchsteuern der HIV-1-Provirus aus dem Genom von HIV-1-infizierten HeLa-Zellen (siehe "HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle Virologie und Immunologie, Hamburg, Deutschland). Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der "molecular surgery" und molekulare Medizin dienen.
