Summary
Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.
Abstract
Stamcellen hebben de opmerkelijke potentie uit te groeien tot een groot aantal verschillende celtypen. Wanneer een stamcel deelt, elke nieuwe cel de mogelijkheid om ofwel te blijven een stamcel of worden een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie heeft, is deze veelbelovende van de wetenschap vooraanstaande wetenschappers de mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën voor behandeling van de ziekte te onderzoeken. Wanneer cultuur in suspensie zonder antidifferentiation factoren, embryonale stamcellen spontaan differentiëren en vormen drie-dimensionale meercellige aggregaten. Deze cel aggregaten worden genoemd embryoid organen (EB). Opknoping druppel cultuur is een veel gebruikt EB formatie inductie methode. De afgeronde onderkant van opknoping druppel maakt de samenvoeging van de ES-cellen die kunnen zorgen voor MES-cellen een goede omgeving voor het vormen van EBS. Het aantal van de ES-cellen aggregatied in een opknoping druppel kan worden geregeld door het variëren van het aantal cellen in de eerste celsuspensie te worden opgehangen als een druppel uit het deksel van de petrischaal. Met behulp van deze methode kunnen we reproduceerbare vorm homogene EBS vanuit een vooraf bepaald aantal ES-cellen.
Protocol
- Gelatineren T75 fles met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator 's nachts een dag voor.
- Haal de MES-cellen van broeden, zuig het medium, spoel de ES-cel-cultuur met PBS, toe te voegen 0,05% trypsine oplossing voor laag de bodem van de schaal (2 ml/100mm plaat).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer een minuut, totdat de cellen afstoten van de plaat.
- Voorzichtig vermaal (pipet op en neer) de getrypsiniseerd cellen vier tot zes keer naar de ES-cellen met een aangesloten Pasteur pipet verspreiden,. Breng de verspreide ES-cellen in een 15-ml conische centrifugebuis met voorverwarmde (37 ° C) MES medium.
- Verzamel cellen door centrifugeren. Zuig het supernatant, Voeg 10 ml van MES medium en pipet op en neer om een enkele celsuspensie te vormen.
- Breng de celsuspensie in een T75 fles pre-gecoat met 0,1% gelatine en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2 voor een uur
* Na een uur, zijn de fibroblasten aan de plaat, maar de stamcellen blijven in het medium. Pipetteer het medium om de stamcellen te verzamelen. - Spin de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en zuig uit de MES medium. Voeg vervolgens nog eens 10 ml van MES differentiatie medium en resuspendeer de cellen door repetitieve pipetteren totdat blijkt dat er een fijne suspensie van cellen.
- Tellen cellen met een hemocytometer gebruik differentiatie medium om de stamcellen schorsing verdunnen tot een concentratie van 400 tot 500 cellen per 20ul (20ul/drop) in een steriele bekken.
- Til het deksel voorzichtig omkeren en plaats deze op de top van het schaaltje met 10 ml PBS. Met behulp van een multichannel pipet, maken rijen van 20ul druppels op de up-keerde binnenkant van het deksel van de weefselkweek schotel.
- Plaats voorzichtig de schaal in de incubator voor 2 dagen. Na twee dagen, voorzichtig draai het bord te dekken, aspiratie 180 ul vers medium differentiatie en doe enkele druppels in de put van een 96-well Ultra-wandplaat. Dan pick-up van de druppel met de pipet en overdracht druppels, een voor een, aan de 96-well plaat. Leg de platen in de incubator ongestoord gedurende 3 dagen.
- Coat elk putje van een 48-well plaat met weefselkweek 300ul van 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine, 's nachts incuberen van de plaat bij 37 ° C een dag van tevoren vóór de overdracht van de Ebs.
- De volgende dag, zuigen de gelatine uit de 48-well plaat. Voeg vervolgens 300 ul van differentiatie medium aan elk putje. Breng de EBS van de platen met 96 putjes om de 48 goed gelatine-gecoate platen een voor een. Verander het medium de volgende dag en wijzigt u vervolgens het medium om de andere dag naar de cellen te behouden.
- Spontane cardiaomyocyte contracties moet blijken binnen 7 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nadelen van opknoping drop methode zijn als volgt: de vloeistof volume van een druppel is beperkt tot minder dan 50ul te wijten aan het behoud van opknoping druppels op het deksel door oppervlaktespanning, en het is onmogelijk om het medium te veranderen voor opknoping druppels. Observatie van het vormen van EBS in druppels direct met microscopie is ook zeer moeilijk tijdens de teelt. Verder, de opknoping druppel methode bestaat uit twee stappen, kan daarom een reeks stap van de opknoping drop methode lastig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
