Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية الحفاظ على نمو خلايا المنشأ الجنينية البشرية (hESCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية وكيفية hESCs مرور مستمرة في تغذية الخلايا خالية من الشروط. تأكيد hESC تعدد القدرات التي تزرع في تغذية الخلايا خالية من الشروط التي المجهري المناعي ويتجلى أيضا. الجزء 2 من 3.
Abstract
هذا الفيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF) الخلايا المغذية ، وكيفية الانتقال من لوحات hESCs MEF لتغذية خالية من الخلايا لوحات Matrigel.
Protocol
hESC صيانة الثقافة اليومية
- يجب تغيير الثقافة وسائل الإعلام كل ساعة hESC 24. من المخزون ES زجاجة الوسائط المخزنة في 4 درجات مئوية ، واخراج كمية من محلول اللازمة (~ 20ml في 6 - جيدا لوحة) ، ضع في أنبوب الصقر 50ml ، ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. بمجرد تحسنت وسائل الإعلام ، إضافة bFGF المخزنة في 4 درجات مئوية إلى التركيز النهائي لل10ng/ml. طرح الأسهم bFGF الوراء في 4 درجات مئوية بعد الاستعمال مباشرة!
- إزالة لوحات من 6 جيدا في جميع ~ 500μl لكن وسائل الإعلام. تأكد من دوامة الطبق الثقافة بتعليق لازالة الحطام. تأكد من أن وسائل الإعلام في bFGF الثقافة hESC يختلط جيدا وإضافة وسائل جديدة 3ml مرة أخرى إلى كل بئر من لوحة 6 - جيدا. وضع لوحة في مؤخرة الحاضنة.
تقسيم hESCs من MEFs على Matrigel
عادة ما يمكن تقسيم متموجة 6 - جيدا على طبق من hESCs MEFs 1:02 حتي 01:03 Matrigel على 6 لوحات جيدا ، مع الآبار تصبح متكدسة مرة أخرى 4-5 أيام بعد انفصالها.
- عندما يستخدم على تقسيم hESCs Matrigel ، MEF مكيفة وسائل الاعلام (CM) للحفاظ على تعدد القدرات. يرصد MEF مكيفة وسائل الاعلام مقدما. في اليوم الأول ، والمصنفة 1.5 × 10 7 - γ MEFs المشع في قارورة T75. في اليوم الثاني ، يتم غسلها MEFs مرة واحدة مع درجة حرارة الغرفة 1 × PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، ثم يضاف 15ml من وسائل الإعلام وفاق تستكمل مع bFGF 5ng/ml إلى القارورة. (ملاحظة : يمكن مطلي MEFs في قوارير أصغر أو أكبر ولكن النسبة بين كثافة الخلايا وحجم وسائل الإعلام ينبغي أن يكون وفاق دائم.) هو المحتضنة القارورة في درجة مئوية لمدة 37 ساعة 24. في اليوم الثالث ، يتم جمع CM واستبدالها 15ml من وسائل الإعلام وفاق جديدة تستكمل مع bFGF 5ng/ml. يتم تخزين CM جمعها في 4 درجة مئوية. ويتم حصاد MEF مكيفة وسائل الاعلام من الطلاء من MEFs على مدى سبعة أيام متتالية لتوليد 15 × 7 = 105ml. بعد سبعة أيام ، يتم دمج جميع الكسور CM ، العقيمة التي تمت تصفيتها ، وتخزينها في aliquoted -20 درجة مئوية. أعدت وسائل الاعلام كما هو موضح CM يمكن تخزينها واستخدامها في 1 الشهر.
- قبل يوم واحد تقسيم hESC ، وطرح aliquots Matrigel في أنابيب إيبندورف في 4 درجات مئوية لذوبان الجليد بين عشية وضحاها (واحد يحتوي على 76.2mg قسامة من Matrigel ، وهذا هو المبلغ اللازم لوحة 6 - جيدا واحد). يوم تقسيم ، تأخذ واحدة من القارورة Matrigel إذابة لوحة 6 - جيدا واحد ، وضع قنينة من وسائل الإعلام و6ml DMEM/F12 الباردة على الجليد. نقل إلى وسائل الإعلام Matrigel DMEM/F12 وتخلط جيدا. إضافة 1ml من حل كل بئر من لوحة 6 - جيدا. دوامة لوحة توزيع Matrigel على سطح اللوحة ، واحتضان Matrigel مغطاة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل تقسيم hESCs.
- يتم غسلها على hESCs MEFs مرة واحدة مع 1 × PBS ، ودرجة الحموضة 7.4. وأضاف في وقت لاحق من 1ml الرابع كولاجيناز الدافئة (1mg/ml) إلى كل جانب من لوحة 6 - جيدا ثم يتم تحضين لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
- إضافة 1ml من وسائل الإعلام من دون وفاق bFGF إلى كل بئر. استخدام ماصة 1ml لتفجير الخلايا الجذعية خارج اللوحة. جمع كل وسائل الإعلام التي تحتوي على كتل من hESCs وMEFs القتلى في أنبوب الصقر 50ml. اسمحوا كتل كبيرة من الخلايا لتسوية 50-10 دقيقة حتى يتسنى للكتل hESC تشكيل بيليه في أسفل الأنبوب ، بينما تظل معلقة في MEFs في طاف. تجاهل طاف ، وتغسل عن طريق إعادة التعليق على بيليه hESC باستخدام وسائل الإعلام التي تفتقر إلى وفاق bFGF ، تليها الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 200G لمدة 5 دقائق.
- لوحة الخلايا الجذعية على لوحات Matrigel ، وغسل أول لوحات Matrigel مع درجة حرارة الغرفة DMEM/F12 (1ml لكل بئر) وإضافة 2.5ml من CM تستكمل مع bFGF 10ng/ml لكل بئر. Resuspend الكرية في حجم مناسب لCM تستكمل مع bFGF 10ng/ml ، ماصة تعليق خلية صعودا وهبوطا عدة مرات حتى تصبح موحدة وكتل صغيرة في الحجم. قسامة التعليق في 0.5ml لكل بئر على لوحة Matrigel. علما بأن كثافة مستعمرة على Matrigel أعلى من كثافة المستعمرات من خلال تقسيم المعتاد على MEFs. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة.
- للحفاظ على hESCs على Matrigel ، يتم تغيير وسائل الاعلام CM تستكمل مع bFGF 10ng/ml كل ساعة لمدة تصل إلى 24 يوما 4-5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الفيديو يوضح كيفية الانتقال من لوحات hESCs MEF لوحات التغذية Matrigel خالية من الخلايا. علما بأن كثافة مستعمرة على Matrigel أعلى من كثافة المستعمرات من خلال تقسيم المعتاد على MEFs. وهناك حاجة وتلطيخ المناعي الخلوي المجهري أو تدفق للعلامات hESC تعدد القدرات ، مثل أكتوبر وSSEA - 4 - 4 ، لتأكيد الحفاظ على hESCs في حالة غير متمايزة في ظروف خالية من الثقافة الفرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وتدعم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 - 00313. نشكر أعضاء المركز واسع في الطب التجديدي ، وأبحاث الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا ، وخصوصا الدكتور Amander كلارك ، والدكتور جيروم زاك ، وأعضاء معهد الجذعية في جامعة كاليفورنيا واسع مرفق الخلية الأساسية لدعمهم لدراساتنا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
