Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC 's van MEFs op Matrigel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen, hoe passage hESC' s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen.
Protocol
hESC cultuur dagelijks onderhoud
- hESC cultuur media moeten worden veranderd om de 24 uur. Van de ES media voorraad fles bewaard bij 4 ° C, neemt de hoeveelheid oplossing nodig is (~ 20 ml per 6-well plaat), plaats in een 50 ml falcon buis, en warm tot 37 ° C in een waterbad. Zodra de media is opgewarmd, voeg bFGF opgeslagen bij 4 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml. Plaats de bFGF voorraad bij 4 ° C direct na gebruik!
- Alle uit de 6-well platen, maar ~ 500μl van de media. Zorg ervoor dat u werveling van de cultuur schotel om vuil te schorsen voor verwijdering. Zorg ervoor dat de bFGF in de hESC cultuur media wordt grondig gemengd en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze video laat zien hoe passage hESC 's van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat te bevestigen in feeder-vrije kweekomstandigheden.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Niet-essentiële aminozuren | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagens | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagens | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagens | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagens | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicilline / Streptomycine | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatine | Reagens | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagens | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antilichaam | Reagens | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrine-geconjugeerde muis IgG3 | Reagens | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC-geconjugeerde antirabbit IgG | Reagens | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Referenties
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
