Summary
Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.
Abstract
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen, hoe passage hESC' s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen.
Protocol
hESC cultuur dagelijks onderhoud
- hESC cultuur media moeten worden veranderd om de 24 uur. Van de ES media voorraad fles bewaard bij 4 ° C, neemt de hoeveelheid oplossing nodig is (~ 20 ml per 6-well plaat), plaats in een 50 ml falcon buis, en warm tot 37 ° C in een waterbad. Zodra de media is opgewarmd, voeg bFGF opgeslagen bij 4 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml. Plaats de bFGF voorraad bij 4 ° C direct na gebruik!
- Alle uit de 6-well platen, maar ~ 500μl van de media. Zorg ervoor dat u werveling van de cultuur schotel om vuil te schorsen voor verwijdering. Zorg ervoor dat de bFGF in de hESC cultuur media wordt grondig gemengd en weer toe te voegen 3 ml van verse media aan elk putje van een 6-wells plaat. Zet de plaat terug in de incubator.
Splitsen van hESC 's van MEFs op Matrigel
Meestal een confluente 6-well plaat van hESC 's op MEFs kunnen worden gesplitst 1u02-01u03 op Matrigel 6-well platen, met de putten worden samenvloeiing weer 4-5 dagen na het splitsen.
- Bij het splitsen van hESC 's op Matrigel, MEF-geconditioneerde media (CM) wordt gebruikt om te behouden pluripotentie. MEF-geconditioneerde medium wordt gemaakt op voorhand. Op de eerste dag, zijn 1,5 × 10 7 γ-bestraalde MEFs gezaaid in een T75 fles. Op de tweede dag, zijn MEFs een keer gewassen met kamertemperatuur 1 × PBS, pH 7,4, en vervolgens 15 ml van ES media aangevuld met 5ng/ml bFGF wordt toegevoegd aan de kolf. (NB: MEFs kunnen worden verzilverd in kleinere of grotere flessen, maar verhouding tussen cel-dichtheid en volume van de ES media moet constant zijn.) Het flesje is geïncubeerd bij 37 ° C voor een ander 24 uur. Op de derde dag, is de CM verzameld en vervangen door 15 ml van de verse ES media aangevuld met 5ng/ml bFGF. De verzamelde CM wordt bewaard bij 4 ° C. MEF-geconditioneerde media van een beplating van MEFs worden geoogst gedurende zeven opeenvolgende dagen tot 15 × 7 = 105ml te genereren. Na zeven dagen worden alle CM fracties samen, steriel gefiltreerd, gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 ° C. CM media bereid zoals beschreven kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor 1 maand.
- Een dag voor hESC splitsen, zet Matrigel porties in Eppendorf buisjes bij 4 ° C te ontdooien 's nachts (een portie bevat 76.2mg van Matrigel, en dit is het bedrag dat nodig voor een 6-wells plaat). Op de dag van splitsing, neem een flacon van de ontdooide Matrigel voor een 6-wells plaat, zet de flacon en 6 ml van de koude DMEM/F12 media op ijs. Breng de Matrigel in de DMEM/F12 media en meng goed. Voeg 1 ml van de oplossing aan elke well van een 6-wells plaat. Swirl de plaat Matrigel verspreiden op het oppervlak en incubeer de Matrigel bedekte plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor het splitsen van de hESC 's.
- hESC 's op MEF worden eenmaal gewassen met 1 x PBS, pH 7,4. Vervolgens 1 ml warm collagenase IV (1mg/ml) wordt toegevoegd aan elk putje van de 6-well plaat en daarna de plaat wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Voeg 1 ml van ES media zonder bFGF aan elke well. Gebruik een 1 ml pipet om de stamcellen te blazen van de plaat. Verzamel alle media die klompen hESC 's en dode MEFs in een 50 ml falcon buis. Laat grote massa's van cellen regelen voor 5-10 min, zodat de hESC klonten vormen een pellet op de bodem van de buis, terwijl de MEF blijven hangen in het supernatant. Gooi het supernatant, en was door resuspenderen de hESC pellet met behulp van ES media ontbreekt bFGF, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur op 200 g gedurende 5 minuten.
- Tot op het bord van de stamcellen op Matrigel borden, Was eerst de Matrigel platen met kamertemperatuur DMEM/F12 (1 ml per putje) en het toevoegen van 2,5 ml van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF per putje. Resuspendeer de pellet in een geschikt volume van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF, pipet de celsuspensie op en neer een paar keer totdat de klonten worden uniform en klein van formaat. Aliquot de suspensie bij 0,5 ml per goed op de Matrigel plaat. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator.
- Handhaving van de hESC 's op Matrigel, is CM media aangevuld met 10ng/ml bFGF veranderd elke 24 uur tot 4-5 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video laat zien hoe passage hESC 's van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat te bevestigen in feeder-vrije kweekomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
