Summary
Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.
Abstract
Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione, come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel.
Protocol
hESC manutenzione cultura quotidiana
- terreni di coltura hESC deve essere cambiato ogni 24 ore. Dalla bottiglia ES magazzino multimediali memorizzati a 4 ° C, estrarre la quantità di soluzione necessaria (~ 20ml per 6 pozzetti), posto in un tubo da 50 ml falco, e calda a 37 ° C in un bagno d'acqua. Una volta che la media è riscaldato, aggiungere bFGF conservato a 4 ° C ad una concentrazione finale di 10ng/ml. Mettete il brodo bFGF torna a 4 ° C subito dopo l'uso!
- Togliere dal 6 pozzetti tutti ma ~ 500μl dei media. Assicurati di agitare il piatto cultura di sospendere i detriti per la rimozione. Assicurarsi che il bFGF in terreni di coltura del hESC sia ben mescolata e aggiungere 3 ml di mezzi freschi di nuovo in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
HESC scissione dal MEF sul Matrigel
Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC sul MEF possono essere divisi 1:02-1:03 su Matrigel piatti 6-bene, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione.
- Quando hESC suddivisione su Matrigel, MEF condizionata media (CM) è usato per mantenere la pluripotenza. MEF condizionata media è in anticipo. Il primo giorno, 1,5 × 10 7 γ-irradiati MEF sono seminati in un pallone T75. Il secondo giorno, MEF vengono lavati una volta con temperatura ambiente 1 × PBS, pH 7,4, e poi 15 ml di media ES integrato con 5ng/ml bFGF si aggiunge al pallone. (NOTA: MEF può essere placcato in fiasche più piccole o più grandi, ma proporzione tra la densità delle cellule e il volume dei mezzi di comunicazione ES deve essere costante.) Il pallone viene incubata a 37 ° C per altre 24 ore. Il terzo giorno, il CM è raccolto e sostituito con 15 ml di media ES fresca integrato con 5ng/ml bFGF. Il CM raccolto viene conservato a 4 ° C. MEF condizionata da una placcatura mezzi di MEF sono raccolte più di sette giorni consecutivi di generare 15 × 7 = 105ml. Dopo sette giorni, tutte le frazioni CM sono combinati, sterile filtrata, aliquotati e conservati a -20 ° C. Mezzi di comunicazione CM preparato come descritto possono essere memorizzati e utilizzati per 1 mese.
- Un giorno prima divisione hESC, messo aliquote Matrigel in tubi eppendorf a 4 ° C per scongelare tutta la notte (una aliquota contiene 76.2mg di Matrigel, e questo è l'importo necessario per un 6-pozzetti). Il giorno della scissione, prendere un flaconcino di Matrigel scongelati per un 6-pozzetti, mettere il flaconcino e 6 ml di freddo DMEM/F12 multimediale su ghiaccio. Trasferire il Matrigel nel DMEM/F12 media e mescolare bene. Aggiungere 1 ml della soluzione in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Agitare la piastra per distribuire Matrigel sulla superficie e incubare il Matrigel coperto di piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di dividere la hESC.
- hESC il MEF sono lavati una volta con 1 × PBS, pH 7,4. Successivamente 1 ml di caldo collagenasi IV (1mg/ml) viene aggiunto in ciascun pozzetto della piastra ben 6 e poi la piastra viene incubata a 37 ° C per 5-10 min.
- Aggiungere 1ml di media ES senza bFGF in ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta 1 ml di far saltare le cellule staminali fuori dal piatto. Raccogliere tutti i supporti contenenti grumi di hESC e morti MEF in una provetta da 50 ml falco. Lasciate grumi di cellule grandi accontentarsi di 5-10 minuti in modo che le macchie hESC forma una pallina sul fondo della provetta mentre il MEF rimangono sospese nel supernatante. Eliminare il supernatante e lavare da risospendere il pellet mezzi hESC ES manca bFGF, seguita da centrifugazione a temperatura ambiente a 200 g per 5 min.
- Alla piastra le cellule staminali su piastre Matrigel, prima lavare i piatti Matrigel con temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml per pozzetto) e l'aggiunta di 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù parecchie volte fino a quando le macchie diventano uniformi e di piccole dimensioni. Aliquota la sospensione a 0,5 ml per pozzetto sul piatto Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore.
- Per mantenere la hESC su Matrigel, media CM integrato con 10ng/ml bFGF è cambiato ogni 24 ore per un massimo di 4-5 giorni.
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Discussion
Questo video mostra come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Immunofluorescenza e la citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Oct-4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato di alimentazione priva di condizioni di coltura.
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Acknowledgments
Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
