Summary
本视频演示了如何维持人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）在馈线无细胞的条件和如何在馈线不断通过人类胚胎干细胞的无细胞条件的增长。在馈线无细胞的条件下，免疫荧光显微镜确认的人类胚胎干细胞的全能性增长也表明。
Abstract
本视频演示了如何生长在人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞，如何通过MEF的板人类胚胎干细胞馈线无细胞基质胶板。
Protocol
人类胚胎干细胞文化的日常维护
- 人类胚胎干细胞的培养基必须24小时更换一次。从ES传媒股票在4 ° C储存瓶，拿出解决方案所需（〜20毫升每6孔板），在一个50毫升猎鹰管地方，和温暖的37℃水浴中。一旦媒体被加热，添加碱性成纤维细胞生长因子保存在4 ° C的终浓度在10ng/ml。在4 ° C，使用后立即把碱性成纤维细胞生长因子股票！
- 从6孔板删除，但〜媒体500μL。确保摇动培养皿暂停去除碎片。确保碱性成纤维细胞生长因子在人类胚胎干细胞的培养基充分混合，并添加新媒体3毫升每孔6孔板。把孵化器板的背面。
到基质胶从MEFs分裂的胚胎干细胞
通常一个融合的6孔板MEFs的人类胚胎干细胞可以分割1:2至1:3到基质胶6孔板，井成为融合再次分裂后的4-5天。
- 到基质胶，MEF的条件培养基（CM）分裂的胚胎干细胞是用来维持全能性。 MEF空调媒体提前。在第一天，1.5 × 10 7γ-辐照MEFs种子成T75烧瓶。第二天，MEFs洗一次与室温1 × PBS，pH值7.4，然后再辅以5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ES媒体15毫升添加到烧瓶中。 （注：MEFs可镀成更小或更大的烧瓶，但细胞的密度和体积的ES媒体之间的比例应该是恒定的。）烧瓶中孵育24小时，在37 ° C。第三天，CM的收集和更换新鲜胚胎干5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的培养基15毫升。收集到的CM是储存在4 ° C MEF空调从一个MEFs电镀媒体收获了连续七天，产生15 × 7 =105毫升。七天后，所有CM的分数相结合，无菌过滤，分装并储存于-20 ° C CM媒体准备所述，可以存储和使用1个月。
- 人类胚胎干细胞分裂前的一天，在Eppendorf管基质胶分装在4 ° C解冻过夜（之一等分包含基质胶76.2mg，这是一个6孔板所需的金额）。在分裂的一天，一个6孔板解冻基质胶瓶，小瓶和冷的DMEM/F12媒体6毫升置于冰上。转移到的DMEM/F12媒体的基质胶拌匀。每孔6孔板的解决方案添加1ml到。旋流板的表面上散布基质胶及基质胶覆盖板在室温孵育至少1小时前分裂的胚胎干细胞。
- 1 × PBS，pH值7.4 MEFs上的人类胚胎干细胞是洗一次。随后1毫升是温暖的胶原酶（1mg/ml的）添加到每个6孔板以及，然后该板块在37 °为5-10分钟彗星。
- 无碱性成纤维细胞生长因子ES媒体1ml到每口井。使用1毫升吸管吹断板的干细胞。收集所有的媒体，将含有人类胚胎干细胞和死MEFs一个50毫升猎鹰管团块。让大的细胞团块为5-10分钟定居，使胚胎干细胞团块，在试管底部形成一个颗粒而MEFs暂停留在上清液。弃上清，洗resuspending的人类胚胎干细胞颗粒缺乏碱性成纤维细胞生长因子在室温下离心5分钟，随后在200克使用es媒体。
- 基质胶板的板体干细胞，先用室温的DMEM/F12（每孔1毫升）和在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子补充CM每孔加入2.5毫升基质胶板。补充吸管在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，细胞悬液和向下几次直到均匀，体积小的团块成为在一个适当的CM量重悬沉淀。基质胶盘分装在每口井0.5毫升暂停。请注意，对基质胶的殖民地密度高于MEFs通常分裂菌落密度。放置在37℃组织培养箱内培养板。
- 为了保持基质胶上的人类胚胎干细胞，在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子补充的招商媒体是改为每24小时4-5天。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本视频演示了如何通过胚胎干细胞MEF板料器无细胞基质胶板。请注意，对基质胶的殖民地密度高于MEFs通常分裂菌落密度。人类胚胎干细胞全能性的标志物，如Oct - 4和SSEA - 4，免疫荧光染色和显微镜或流式细胞仪需要在馈线的文化条件，以确认人类胚胎干细胞保持在未分化状态。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
在Teitell实验室的人类胚胎干细胞研究是由加州再生医学研究所（CIRM）种子批RS1 - 00313的支持。我们感谢的再生医学和干细胞研究的加州大学洛杉矶分校，特别是博士Amander克拉克，博士杰罗姆扎克，和加州大学洛杉矶分校的Broad研究所干细胞核心设施为支持我们的研究成员的广泛中心的成员。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
