Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

doi: 10.3791/833 Published: August 15, 2008

Summary

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

Abstract

טראנסגנטי Caenorhabditis elegans ניתן ליצור בקלות דרך microinjection של פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך בלוטת המין 1. ה-DNA פלסמיד מארגן מחדש כדי ליצור concatamers extrachromosomal כי הם ירשו ביציבות, למרות שלא כמו כרומוזומים בפועל 2 עם יעילות זהה. הגן של עניין הוא שיתוף מוזרק עם סמן פנוטיפי ברור, כגון רול-6 או ה-GFP, כדי לאפשר בחירה של בעלי חיים מהונדס תחת מיקרוסקופ לנתח. הגן אקסוגני יכול להיות מבוטא מן האמרגן שלו דובר ללימודי לוקליזציה הסלולר. לחלופין, transgene יכול להיות מונע על ידי האמרגן שונה ברקמות ספציפיות על מנת להעריך את התפקיד של המוצר גנים תא רקמה מסוימת. טכניקה זו יעילה כוננים ביטוי הגן בכל רקמות של C. elegans למעט העובר germline או בתחילת 3. יצירת חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב עבור מגוון של פרדיגמות הניסוי. וידאו זה מדגים את הליך microinjection לייצר תולעים מהונדס. יתר על כן, הבחירה ותחזוקה של יציבה מהונדס C. elegans קווי מתואר.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הביטוי פלסמיד בנייה

שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה.

ניסיוני פלסמיד

  1. בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, למשל, עצב או שריר ספציפי האמרגן. אם אחד הוא להביע גנים מרובים בתוך הרקמה באותו קלטת האמרגן פלסמיד במערכת Gateway (Invitrogen) יכול לשמש. גישה זו מאפשרת החדרת גן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי 4 שיבוט recombinational. ככלל, 2-5 קילו של רצפים הזרם מספיקה יש ביטוי נכון ומדויק.

  2. CDNA של הגן של עניין ניתן לשכפל בשתי דרכים:
    1. שיבוט קונבנציונלי באמצעות אנזימי הגבלה.
    2. עבור שיבוט Gateway, הוא מוגבר באמצעות PCR primers המכילים את עו"ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך pDONR201 התורם וקטור כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5a. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור המכיל מקדם היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. 5.

דה מרקר לבחירה פלסמיד

דוגמאות של פלסמידים סמן מהונדס כוללים רול-6 או שימוש מקדם קיר השרירים בגוף UNC-54 לנהוג ביטוי חלבון פלואורסצנטי. אלה פלסמידים סמן זמינים בדרך כלל מתוך הקהילה מחקר על פי דרישה.

Microinjection של C. elegans

הכנה

  1. ביצוע בידוד DNA של שני פלסמידים, כי הם להיות מוזרק. לכמת אותם ומערבבים יחד ביחס של 1:1 של 50 ng / μl כל אחד.

  2. הכנת כריות אגר:
    1. הפוך את פתרון 2% agarose במים; חום או במיקרוגל עד שהיא נמסה.
    2. הגדר את מספר 22 x 50 מ"מ על המשקפיים לכסות benchtop.
    3. בעזרת פיפטה פסטר, במקום ירידה של agarose נמס על כוס אחת לכסות מיד במקום זכוכית העטיפה השנייה על ירידה בזווית של 90 על הראשונה. חזור על מספר המשקפיים לכסות אחרים. הקוטר של הדיסק שטוח של agarose צריך להיות בין 15-20 מ"מ.
    4. לאחר agarose יש הקרושה (זה לוקח רק רגעים), להסיר את הזכוכית המכסה ולאפשר כרית אוויר יבש לגמרי (כמה שעות בלילה).
    5. חנות כריות בתא זכוכית לכסות בטמפרטורת החדר.

  3. הפוך את מעמיסים מחט פתרון ה-DNA:

    מעמיסים מחט נוצרות 100 צינורות נימי μl כי מחוממים באמצע מעל להבה פתוחה ומשך במהירות אורך כ פעמיים שלהם. שני חצאים הם התיז מלבד פעם את צינור נימי מתקרר. לאגור 10-20 מעמיסים מחט להזרקה. חנות זקוף מתלה צינור microcentrifuge. היזהר שלא לדקור את עצמך על הנקודות.

  4. הפוך את המחטים microinjection:

    המחט עשוי צינור נימי מיוחד המכיל סיב זכוכית פנימית; נימה זו משמשת הפתיל עבור פתרון ה-DNA. אלה משכו במחשב מחט חולץ. אנו משתמשים PP-830 Narishige חולץ עם הגדרה חום של 24.8. כמה מחטים נמשכים בכל פעם מאוחסנים בקופסת פלסטיק קטנה. מחטים מרובות ניתן בקלות "רכוב" על פיסת פלסטלינה עבור אחסון לטווח ארוך.

  5. קצה המחט "פורעי":

    קצה המחט microinjection נמשך קנס כך שהיא למעשה סגורה על זה בסוף וצריך שבור פתוח באמצעות רסיסים קטנים של זכוכית המכסה. אלה מוכנים על ידי לפפה 18 x 18 מ"מ זכוכית לכסות במגבת נייר ובעדינות הפעלת לחץ עד שהוא נשבר לחתיכות מספר. שברי גודל שימושי כ 3 x 4 מ"מ.

  6. לגדול פרא (N2) תולעים סוג לשלב הבגרות המוקדמת להזרקה באמצעות נהלים תקן 6. הכן על 100 מבוים כהלכה תולעים / לבנות מוזרק.

נוהל

  1. פתח את השסתום הראשי על טנק הליום המחובר זרוע microinjection המחט מחזיק. סגור את שסתום הרגולטור על מנת לאפשר הגז כדי להזין את הקו, להביא את הלחץ עד 35 psi. שימו לב כי גז ניתן לשחרר באמצעות דוושת רגל.

  2. הכנס מטעין מחט לתוך צינורות pipetter תקן הפה (נמצא במיכלים של צינורות זכוכית נימי) וכן להכין כמות קטנה של התערובת פלסמיד (~ 1 μl).

  3. מטעין המחט ממוקם בזהירות לתוך האחורי של מחט מזרק ונוסף בעדינות לאורך כל הדרך באורך שלהמחט עד התנגדות מורגשת. לגרש את פתרון ה-DNA על ידי נושבת בעדינות, ולאחר מכן להסיר את מטעין.

  4. הכנס את המחט בזרוע microinjection, נזהר כדי למקם אותה בתוך אטם גומי קטן הפנימי.

  5. מקום שבר מחט שבירת הכוס לכסות על קצה אחד של משטח אגר. מכסים את הרסיס, כמו גם את פני השטח של כל כרית אגר, עם שמן halocarbon. הנח את כרית אגר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.

  6. מקמו את המחט במרכז השדה צפייה באמצעות המטרה 4X ואת התאורה שדה בהיר, אבל עדיין לא הורידו אותה לתוך השמן. כמו כן, עמדת הקצה הפנימי של רסיס של זכוכית לכסות במרכז, ולאחר מכן להתמקד בה (עדיין משתמש המטרה 4X). מנמיכים את מחט לתוך השמן, להביא אותו לתוך המטוס מוקד כמו רסיס של זכוכית המכסה. תרים את ההגדלה ידי מעבר המטרה 40X. מקדו מחדש על סף שבר ואת למקם את קצה המחט, במידת הצורך.

  7. כדי לפתוח את קצה מחט הזריקה, דחיפה בעדינות את המחט על קצה הזכוכית המכסה שבר, ואילו באותו זמן החלת פולסים קצרים של גז באמצעות דוושת רגל. המחט יהיה שבור מספיק פתוח כאשר טיפות קטנות של נוזל לברוח לסוף המחט. זרימת נוזל עודף בשל פתיחת גדולה מדי אינו רצוי, שכן הוא יהרוג את החיות.

  8. הסר את כרית אגר משלב ידי הרמת את המחט, אבל לא לשנות את ה-X או ציר Y המיקום. החלק את הבמה החוצה מתחת למחט, הסר את פנקס אגר ומניחים אותו על גבי מיקרוסקופ לנתח. העברת תולעת על כרית, מתחת לפני השטח של השמן. אם תולעת מתפתלת, שבץ בעדינות עד שהוא קשר את הפנקס אגר. התולעת לח צריך לדבוק agarose יבש.

  9. הזרקה
    1. במהירות למקום לרפד אגר בחזרה אל הבמה, מרכוז תולעת בתחום התצוגה.
    2. מנמיכים את מחט לתוך המטוס אותו להתמקד כמו התולעת.
    3. החלף את המסננים כדי הופמן תאורה (סוג של מסנן ניגודיות). זה מאפשר פרט המורפולוגי של התולעת להיות גלוי. אם Nomarski / אופטיקה DIC זמינים על היקף הפוך זה יעבוד גם. שימוש המטרה 40X, להתמקד במרכז "מגורען" סינסיציאלי של בלוטת המין התולעת, מתחת דפוס "חלת דבש" של גרעיני נבט (לבחור לפי אשך ממוקם בצד של התולעת מול מחט).
    4. לכוונן את המיקום של המחט עד קצה גם בפוקוס (את המטוס כמו "גרעיניות" את בלוטת המין).
    5. הכנס בעדינות את המחט למרכז אשך ולהחיל הדופק קצרה של לחץ הגז לגרש טיפה או שתיים של דנ"א לתוך הזרוע בלוטת המין. אתה צריך לראות גל של התפשטות הנוזל על פני אשך הדיסטלית. אל תניחו נוזלי יותר הוא טוב יותר, שכן נוזלי מדי יכול לזרום לתוך העיקול הפרוקסימלי של הזרוע בלוטת המין, אשר יכול לסגור ייצור הביצית. במידת האפשר, בהתאם למיקום של התולעת, להזריק הזרוע בלוטת המין השני באותו אופן.
    6. חשוב לעבוד במהירות תוך הזרקת תולעת, כפי שהוא יכול בקלות ליבש. ההחלטה להזרים הזרוע בלוטת המין השני הוא תלוי כמה מהר אתה יכול מחדש לתפקיד תולעת המחט. התהליך כולו רצוי לקחת פחות מ 1-2 דקות.

  10. הסר את מכסה זכוכית משלב ולמקם אותו על היקף הניתוחים. החל 1μl של M9 חיץ (22mm KH 2 PO 4, 42mM Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mm MgSO 4) ישירות על גבי התולעת מוזרק (זו עלולה להביא לפעולה והטביע את קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנפט halocarbon). המאגר אמור רעננותם התולעת, הוא יהיה אז לצוף מעל פני השטח משטח agarose. מעבירים את התולעת לצלחת קבוע באמצעות לאסוף תולעת. כרית agarose ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים עד שזה יותר הפך רווי מדי עם חיץ התולעים כבר לא לדבוק.

טראנסגנטי בחירה

  1. תולעים מוזרק, דור P 0, מועברים הפרט, צלחות טרי seeded bacterially (60 מ"מ) מותר להתרבות. בדרך כלל, בעלי חיים מוזרק מודגרת על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.

  2. הצאצאים 1 F הם נצפו ראיות של הסמן מהונדס (כגון פלואורסצנטי) באמצעות stereomicroscope ניאון. כל נושא ניאון, F 1, בעלי חיים משובטים היא בנפרד לצלחת חדשה (מאז צאצאים של F כל 1 נחשבים קו מובהק). F 1 הרמפרודיטים מותר להתרבות. שוב, זה מתבצע בדרך כלל על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.

  3. דור 2 F הוא ציין לבעלי חיים מהונדס גם כן. F 2 חיות ירשו ולהביע את מערך מהונדס נחשבים קו "יציב".

    הערה: לכל 1 F רחובגיל ייתכנו חיים מהונדס רבים, אך הם אינם יציבים. רוב F 1 חיות טרנסגניות לא יופצו לתוך F 2 קווי יציב.

    הערה: כדי לשלוט על השתנות במספר עותק הגן, ליצור מינימום של שלוש שורות יציב עצמאית לכל לבנות מוזרק.

  4. כל שורה יציבה עצמאי צריך להישמר כפי בשורה נפרדת של תולעים. כל שורה יכולה להיות מופצות על ידי העברת בעלי חיים מהונדס מספר לוחית חדשה בכל דור, זה חייב להתבצע באמצעות stereomicroscope פלורסנט אם את הסמן לבחירה הוא פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כשעושים הליך זה, חשוב לזכור:
- להזריק ישירות למרכז אשך
- לא להזריק יותר מדי נוזלים
- עובדים מהר כדי למנוע dessication.

אם אתה נתקל בבעיות עם מחט, כגון זה נשבר גדול מדי, עדיף מהדורה מחודשת מחט טריים, במקום לנסות להזריק עם מחט פחות אידיאלי.

הדור של תולעים מהונדס יש יישומים רבים, כגון:
- זיהוי של גנים שעברו מוטציה, בשיטה המכונה הצלה שינוי
- מיפוי של תחומים חלבון דרך ביטוי של חלבונים מקוצץ
- אפיון התפקיד של הגן בתהליכים תאיים ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss & פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג'יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).More

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter