Summary
La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la tuberculosis (TB) y la tuberculosis multirresistente (TB-MDR). Este vídeo describe el líquido MODS medios método de cultivo.
Abstract
Los pacientes con tuberculosis pulmonar activa (TB) infectan 10-15 personas por año, por lo que el diagnóstico de tuberculosis activa esencial tanto para la curación del paciente y prevenir nuevas infecciones. Por otra parte, la aparición de tuberculosis multirresistente (TB-MDR) significa que la detección de resistencia a los medicamentos es necesario para detener la propagación de cepas resistentes. La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la TB y TB MDR. El ensayo MODS se basa en tres principios: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) crece más rápido en medios líquidos que en medios sólidos 2) el crecimiento de MTB microscópica puede ser detectado antes en medios líquidos de esperar a que el aspecto macroscópico de las colonias en medios sólidos, y que el crecimiento es característico de MTB, lo que le permite distinguirse de la contaminación por micobacterias atípicas o por hongos o bacterias 3) los medicamentos isoniazida y la rifampicina pueden ser incorporados en el ensayo de MODS para permitir la detección simultánea directa de la TB-MDR, obviando la necesidad de llevar a cabo la subcultura una prueba indirecta de la susceptibilidad de drogas. La competencia de diagnóstico actuales se ven obstaculizados por la baja sensibilidad con frotis de esputo, las largas demoras hasta el diagnóstico con medio de cultivo sólido, con el costo prohibitivo de los actuales métodos de cultivo líquidos medios de comunicación, y la necesidad de hacer la subcultura de las pruebas indirectas para detectar sensibilidad a los medicamentos TB MDR. En contraste, el método no-propietario MODS tiene una alta sensibilidad para la TB y TB MDR, es un método de cultivo relativamente rápido, proporciona pruebas simultáneas sensibilidad a los medicamentos para la TB-MDR, y se puede acceder a recursos limitados, en poco menos de $ 3 para las pruebas de tuberculosis y TB-MDR.
Protocol
- Preparar soluciones madre
- Fosfato de existencias reguladoras
- Mezclar 950 ml de solución de sodio dibásico (9.47g de fosfato de sodio dibásico disuelto en agua destilada 1000 ml) con 950 ml de solución de fosfato de potasio monobásico (9.07g de fosfato de potasio monobásico disuelto en agua destilada 1000 ml) y se agita; retener 50 ml de cada solución para ajustar pH si es necesario
- Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2: añadir fosfato de sodio dibásico solución para elevar el pH, agregar solución de fosfato monobásico de potasio a un pH más bajo
- Autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos para esterilizar
- Placa de una alícuota de 100μl de la solución amortiguadora de fosfato en el medio de agar nutriente en una placa de Petri y se incuba a 37 ° C durante 48 horas para confirmar la esterilidad
- Guarde en el refrigerador a 2-8 ° C durante un máximo de un mes
Nota: Cada muestra de esputo requiere 10 ml de solución amortiguadora de fosfato
- Descontaminación de valores
- Combinar volúmenes iguales de solución de hidróxido sódico (8,0 g de hidróxido de sodio disuelta en 200 ml de agua destilada estéril) y la solución de citrato de sodio (5,8 g de citrato de sodio en 200 ml de destilado de agua destilada estéril)
- Mezclar y esterilizar en autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos
- Guarde en el refrigerador a 2-8 ° C durante un máximo de un mes
Nota: Cada muestra de esputo requiere 2ml de las acciones de descontaminación
- Los medios de cultivo de valores
- En 900 ml de agua destilada estéril añadir 3.1ml de glicerol y 1,25 g de casitona y 5.9g de polvo de medio 7H9; mezcla con agitación constante hasta que se disuelva
- Autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos
- Dejar enfriar y dividir el medio estéril en alícuotas 4.5ml en estériles 16x 100 mm tubos de vidrio para preparación de muestras y alícuotas de 10.8ml para la preparación de las soluciones de antibióticos y los controles internos
- Se incuba a 37 ° C durante 48 horas para verificar la esterilidad (ausencia de turbidez)
- Almacenar a 2-8 ° C con la tapa bien cerrada para un máximo de un mes
Nota: Cada muestra de esputo requiere un tubo que contiene 4.5ml de medio 7H9
- Las soluciones de antibióticos de valores
- A. La isoniazida acciones (8 mg / ml)
- Disolver 20 mg de isoniazida por completo en 2,5 ml de agua destilada estéril
- Filtro con filtro de jeringa de 0.2μm para solventes acuosos
- Almacenar en alícuotas de 20μl en tubos estériles centrifugación micro a -20 ° C hasta por 6 meses
Nota: Cada alícuota almacenada 20μl es suficiente para un máximo de 100 muestras (incluyendo desperdicios)
- B. La rifampicina acciones (8 mg / ml)
- Disolver 20 mg de rifampicina por completo en 1.25ml DMSO
- Añadir 1.25ml de agua destilada estéril y mezclar
- Filtro con filtro de jeringa de 0.2μm para solventes orgánicos
- Almacenar en alícuotas de 20μl en tubos de microcentrífuga estériles a -20 ° C hasta por 6 meses
Nota: Cada alícuota almacenada 20μl es suficiente para un máximo de 100 muestras (incluyendo desperdicios)
- A. La isoniazida acciones (8 mg / ml)
- Fosfato de existencias reguladoras
- Prepare las soluciones de trabajo
- Solución de trabajo de descontaminación
- Disolver 0,1 g de cristales de NALC en cada 20 ml de solución de descontaminación necesarios
Nota: Cada muestra de 2 ml de solución de las necesidades de descontaminación
Nota: Desechar la solución de descontaminación NaOH-NALC que no se utilice después de 24 horas NALC pierde su actividad mucolítica con el tiempo
- Disolver 0,1 g de cristales de NALC en cada 20 ml de solución de descontaminación necesarios
- Cultura de los medios de solución de trabajo
- Establece:
- 1 tubo con medio 7H9 para cada muestra de esputo para ser procesados, además de un tubo adicional para cada plato (para la columna de control negativo)
- 2 tubos de medio 7H9 para los controles positivos (3 cepas monorresistentes si se utilizan)
- 1-2 tubos con 10.8ml 7H9 para la preparación de una solución antibiótica
- Añadir 0,5 ml OADC al 4.5ml de 7H9 en cada tubo de muestra
- Añadir 1,2 ml OADC a los tubos con 10.8ml 7H9
- Ponga a un lado 2 tubos con 5ml 7H9-OADC para los controles positivos, y el tubo (s) con 12 ml 7H9-OADC a utilizar para la preparación de una solución antibiótica (que no requieren PANTA)
- Reconstituir PANTA y añadir 0,1 ml a cada tubo de muestra y los tubos de control negativo (7H9-OADC-PANTA: volumen total = 5.1ml)
Nota: medio completo con PANTA (7H9-OADC-PANTA) se utiliza para muestras de esputo y los controles negativos, el uso de 7H9-OADC sin PANTA para los controles positivos y para la preparación de una solución antibiótica
- Establece:
- Antibióticos soluciones de trabajo
- 1. En la figura 1 pasos para hacer la solución de antibióticos que trabajan en un 24 sin usar y placa
Nota: Para obtener los resultados de sensibilidad precisa, las concentraciones de antibióticos final son críticos. El siguiente procedimiento es adecuado para laboratories equipado con micropipetas. Si no se dispone de pipetas, jeringas de tuberculina se puede utilizar con una serie de diferentes diluciones se describe en la Guía del usuario Apéndice 3 al modsperu.org
Nota: No vuelva a congelar o re-uso de antibióticos de trabajo o soluciones estándar actividad de la droga se puede perder Descartar las soluciones de antibióticos no utilizados al final del día figura la transformación 1.. Lo que las soluciones de antibióticos de trabajo (de la Guía del usuario en modsperu.org)
- 1. En la figura 1 pasos para hacer la solución de antibióticos que trabajan en un 24 sin usar y placa
- Solución de trabajo de descontaminación
- Muestra de esputo y la placa de preparación
- Descontaminación
- 2ml lugar de muestra de esputo en un tubo de centrífuga de 15 ml (si es menos, que hasta 2 ml con tampón fosfato, si más, use solamente 2 ml)
- Añadir 2 ml de NaOH-NALC solución
- Tubo de tapa y vortex durante 20 segundos, invierta el tubo para asegurar NaOH-NALC contactos solución de la superficie interior del tubo y la tapa
- Deje reposar por un mínimo de 15 minutos - puede prolongar por unos minutos si la muestra es muy viscoso. Para evitar el exceso de tratamiento, no debe exceder los 20 minutos
- Llene el tubo de 14 ml con tampón fosfato (pH 6,8) para neutralizar el álcali y terminar el proceso de descontaminación, y mezclar bien invirtiendo el tubo 4 veces
- Centrifugar a 3000 g durante 15 minutos (véase el apéndice 2 de la Guía del usuario en modsperu.org para la ecuación de revoluciones por minuto necesarias para llegar a 3000 g)
- Elimínese el líquido sobrenadante en un recipiente de residuos líquidos con hipoclorito de sodio al 10% u otro desinfectante adecuado y retener el sedimento
- Preparación de la suspensión de la muestra final y copia de seguridad
- Utilizando 7H9-OADC-PANTA (del tubo que contiene 5.1ml), resuspender el pellet de la muestra en un volumen total de 2 ml en el tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur, mezclar bien
- Retire 1 ml de suspensión de la muestra y guardar en un tubo de microcentrífuga a 2-8 ° C como una copia de seguridad
- Añadir 1 ml de la segunda suspensión de la muestra en el tubo con el resto de 7H9-OADC-PANTA y mezcle bien. Esta es la solución final de la muestra preparada para la siembra
- La colocación de suspensiones de la muestra en 24 y la placa
- Coloque 900μl de la suspensión de la muestra final en cada uno de los 4 pozos de una columna en la placa de 24 pocillos
- Repita el procedimiento con muestras adicionales hasta que todas las columnas de la placa, con excepción de la columna 3, están llenos (o hasta que todas las muestras son colocadas)
- 900μl 7H9-lugar de OADC medio sin muestra en los 4 pozos de la columna 3 de cada plato de muestras (controles internos negativos)
- Añadir antibióticos a las muestras
- Con una pipeta de canales múltiples, llenar cuidadosamente 4 puntas con 100μl de los pozos con soluciones de trabajo 7H9-OADC y antibióticos (columna 2 en la dilución de antibióticos placa-ver Figura 1)
- Añadir las alícuotas de 100μl de la columna 1 pozos con soluciones de muestra 900μl sin tocar la placa o de la muestra
- Repita hasta que todas las columnas han recibido la más 100μl de medio (libre de drogas pozos) o soluciones de antibióticos (incluyendo la columna de control negativo 3)
- Cerrar la placa con su tapa y coloque en un cierre hermético de polietileno (Ziplock) y sellar la bolsa (bolsa no se vuelve a abrir a partir de este punto)
- Se incuba a 37 ° C (enriquecimiento del CO 2 no es necesario)
- Descontaminación
- Control de calidad
- Los controles negativos se practican en cada plato. La presencia de cualquier crecimiento en cualquiera de los pozos en la columna de control negativo indica que la contaminación cruzada, por lo tanto, toda la placa debe ser desechado y las muestras de re-plateado.
- Los controles positivos se ejecutan en un plato aparte, al final del día. Una totalmente sensible a los medicamentos cepa se ejecuta en una columna y una cepa resistente a INH y RIF se ejecuta en otra columna. Si existe la preocupación acerca de la ejecución de una cepa MDR, tanto una cepa monorresistentes INH y RIF monorresistentes una cepa se puede ejecutar en el lugar de las cepas susceptibles y MDR. Todos los controles positivos deberían tener un crecimiento en los pozos sin drogas para demostrar que el crecimiento del apoyo a los medios de comunicación. Para demostrar que las concentraciones de fármaco son correctas, la cepa susceptible no debe crecer en el INH y RIF pozos, pero la cepa MDR debe crecer también crecer en el INH y RIF pozos.
- Placa de la lectura
- Con el día de la siembra como el "Día 0", lectura de matrículas comienza el día 5, y si es negativo el día 5 de lectura se hace cada día (o días alternos en función de la carga de trabajo) hasta el día 14 y luego cada 2-3 días desde el día 15 -21. Las placas se examinaron en unmicroscopio invertido de luz con el objetivo de 10x
- Una cultura positiva es aquella en la que hay dos o más unidades formadoras de colonias (> 2 ufc) en ambos pozos sin drogas. Crecimiento de las micobacterias se parece a principios de pequeñas curvas comas o espirales (días 5-9). La formación de colonias por lo general avanza a "cuerdas" o "enredos" (ver la biblioteca de imágenes en modsperu.org)
- El día en un cultivo es positivo en los 2 libres de drogas pozos, los pozos que contienen drogas debe ser leído. Cualquier crecimiento en la presencia de un fármaco indica la resistencia a ese medicamento.
Nota: Si la lectura de los pozos que contiene el fármaco se hace> una semana después de un cultivo positivo se observó en los pozos sin drogas, esto puede no representar la resistencia de ruptura a través del crecimiento se ve ocasionalmente
- Las muestras que no son positivos en el día 21 se consideran cultivos negativos
- Nubosidad de los pozos es el resultado del crecimiento excesivo de la contaminación, mientras que el crecimiento de micobacterias no da lugar a la nubosidad
- Al término de 21 días las culturas pueden ser descartados. Culturas permanecer en sus bolsas selladas y se colocan en bolsas de autoclave y en autoclave a 121-124 ° C durante 45-60 minutos
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Discussion
El ensayo MODS está dirigido a entornos de recursos limitados. Por primera vez, trae la posibilidad de MODS para la detección rápida de cultivo líquido de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente a los entornos con recursos limitados en poco menos de 3 dólares por prueba. MODS es un no-propietario, metodología iterativa, y la comunidad de MODS está siempre interesada en las mejoras que otros laboratorios han logrado hacer.
Una preocupación recurrente es la bioseguridad de los medios de cultivo líquidos de la tuberculosis ya que los líquidos pueden derramarse o en aerosol. Creemos que el ensayo MODS es más bioseguros que cualquier ensayo que involucró a las pruebas indirectas de sensibilidad a los medicamentos ya que las pruebas indirectas de sensibilidad a los medicamentos implica la manipulación de soluciones muy concentradas de las micobacterias con los riesgos de derrames y aerosoles, en cambio, MODS simplemente consiste en la inoculación de una muestra de esputo en un plato, después de lo cual se cierra la placa dentro de una bolsa de plástico y nunca se abrió de nuevo. Esto es apoyado por los datos procedentes de Corea (Kim 2007), que mostró que el riesgo ocupacional para trabajadores de laboratorio que chapados a cabo muestras de esputo sin hacer pruebas de sensibilidad a las drogas no fue mayor que la de los trabajadores que realizan baciloscopía, en cambio, los que hacen las drogas las pruebas de sensibilidad tienen un riesgo mucho mayor de trabajo para la tuberculosis.
Le recomendamos encarecidamente que ninguno de estos procedimientos llevarse a cabo sin las debidas precauciones para trabajadores de laboratorio. Esto incluye el N-95 máscaras de protección respiratoria personal, de clase 2 cabina de seguridad biológica con aire extraído a través de filtros HEPA y un candado en la puerta del laboratorio para detener la turbulencia del flujo de aire mientras que las muestras están siendo manipulados.
Procedimientos operativos estándar para el procesamiento de las muestras extrapulmonares, una biblioteca de fotos de Mycobacterium tubercuclosis y otro tipo de contaminación por micobacterias, bacterias y hongos, una estrategia de control de calidad recomendados, un procedimiento para la acreditación de laboratorios para comenzar a usar mods, y una hoja de preguntas frecuentes están disponibles en modsperu.org
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Acknowledgments
Queremos agradecer a Sean Fitzwater y Giannina Carmen Luna Colombo para el segmento de crecimiento de la tuberculosis de vídeo time-lapse. Damos las gracias a Marty Roper por su respuesta exhaustiva y excelente durante la edición y la co-autoría de la Guía del usuario, de donde se tomó el actual protocolo sobre todo palabra por palabra. Producción de este video fue financiado por el NIH / Centro Internacional Fogarty http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore contribuyó como miembro Wellcome Trust de Investigación Clínica en Medicina Tropical y Enfermedades Infecciosas en el lector en el Imperial College de Londres (Fellowship premio número 078067/Z/05). Mark F. Brady contribuido como miembro del NIH / Fogarty International Research Center.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher Scientific | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma-Aldrich | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR international | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher Scientific | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
References
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